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Ex vivo Charakterisierung von humanen Autoantigen-spezifischen CD4+ T-Zellen mit Fokus auf Multiple Sklerose
Gamradt, Stefanie
Trotz intensiver Forschung ist unklar, ob Myelin-reaktive CD4+ T-Zellen in der Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) eine relevante Rolle spielen. Ein Grund dafür ist das Fehlen einer Methode für ihre direkte Analyse. In dieser Arbeit ist es mit Hilfe der magnetischen Anreicherung von spezifisch-aktivierten CD154+ konventionellen und CD137+ regulato-rischen T-Zellen in Kombination mit multiparametrischer Durchflusszytometrie gelungen, seltene autoreaktive CD4+ T Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Personen und MS-Patienten direkt ex vivo zu detektieren und detailliert zu charakterisieren.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden autoreaktive CD4+ T-Zellen von gesunden Individuen bezüglich ihrer Frequenz, ihres Phänotyps und ihrer Funktion untersucht. Anschließend wurde der Fokus auf die vergleichende Analyse von T Zellen mit Spezifität für das Myelin basische Protein (MBP), das Myelin-Oligodendrozyten Protein (MOG) und das Proteolipidprotein (PLP) aus MS-Patienten und passenden gesunden Kontrollen gelegt.
CD4+ T-Zellen mit Spezifitäten für Multiple Sklerose-, Diabetes mellitus Typ I- und Myasthenia gravis-assoziierte Antigene waren in allen gesunden Individuen nachweisbar und sind somit ein Bestandteil des normalen T-Zell-Repertoires. Die Frequenz von Myelin-reaktiven T-Zellen unterschied sich dabei zwischen MS-Patienten und gesunden Personen nicht. Ein deutlicher, aber variabler Anteil der Autoantigen-spezifischen T-Zellen wies einen Memory-Phänotyp (CD45RO+) auf. Interes¬santerweise korrelierte der Anteil an autoreaktiven Memory-T Zellen in beiden Probandengruppen mit dem Anteil an CD4+ Memory T-Zellen innerhalb der Gesamt-T Zell-Population. Diese Assoziation war auch für Neoantigen-spezifische T-Zellen ersichtlich. Diese Tatsache spricht gegen eine Autoantigen-induzierte klonale Expansion von Memory T Zellen und weist auf eine initiale Aktivierung durch ein mögliches Fremdantigen hin. In dieser Hinsicht konnte demonstriert werden, dass autoreaktive T-Zell-Linien (TZL) mit verschiedenen, zufällig gewählten mikrobiellen Antigenen kreuzreagieren können, wobei aus dem Memory-Repertoire generierte TZL vorrangig auf virale Antigene reagierten.
Autoantigen-spezifische Memory-T-Zellen waren in der Lage, inflammatorische (TNF-α, IFN-γ, IL-17, GM-CSF) oder B Zell-aktivierende (IL-4, IL-21) Zytokine zu produzieren. Sie wiesen jedoch im Vergleich zum Recall-Antigen Mannoprotein 65 (MP65) von Candida albicans eine deutlich geringere Antigensensitivität auf. Dies weist auf eine eingeschränkte Selektion hochaffiner autoreaktiver T-Zell-Klone oder alternativ eine limitierte funktionelle Aviditätsreifung im Laufe der Immunantwort hin. Zwischen MS-Patienten und gesunden Kontrollen konnten nur wenig ausgeprägte funktionelle Unterschiede innerhalb der Myelin-reaktiven Memory T Zellen gefunden werden. Ein signifikant erhöhter Anteil an Memory T-Zellen sowie CXCR3+/CCR6+ (Th1/Th17) Zellen im Myelin-spezifischen Repertoire von MS-Patienten spiegelte sich aber auch in der totalen CD4+ T-Zell-Population wieder und lässt daher eher auf generelle Veränderungen im Differenzierungs- und Funktionsstatus der CD4+ T-Zellen von MS-Patienten und weniger auf eine Autoantigen-spezifische Modulation schließen.
Neben Myelin-spezifischen konventionellen CD154+ T-Zellen konnten in dieser Arbeit in einer kleinen Probandengruppe Myelin-reaktive regulatorische CD137+ T-Zellen direkt ex vivo detektiert werden. Diese Tatsache eröffnet neue Möglichkeiten für die Erforschung von Toleranzmechanismen auf Antigen-spezifischer Ebene.
Insgesamt konnte die ex vivo Charakterisierung von Myelin-reaktiven T-Zellen aus dem peripheren Blut keine Anhaltspunkte für ihre mögliche Schlüsselrolle bei MS liefern. Diese Ergebnisse können zum Teil die mangelnde Wirksamkeit von spezifischen Immun-therapeutika bei MS erklären, deren Einsatz vorranging auf der immunpathologischen Relevanz Myelin-reaktiver CD4+ T-Zellen im Tiermodell der MS (experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis = EAE) basierte. Der Erkrankungsverlauf im Menschen wird im EAE-Modell unzureichend dargestellt. Der Fokus der Forschung sollte demnach stärker auf die Suche nach relevanten Zielantigenen oder alternativen Tiermodellen und Pathomechanismen gerichtet sein, um die Entwicklung neuer zielgerichteter Therapien zu ermöglichen. Zukünftige Untersuchungen sollten weiterhin klären, ob und inwieweit autoreaktive T-Zellen mit geringer Antigensensitivität zur Pathogenese von Autoimmunerkrankungen beitragen können.
Despite extensive research, it is unclear whether myelin reactive CD4+ T cells are key players in the pathogenesis of multiple sclerosis (MS). This is mainly due to the lack of an appropriate method for their direct identification. In this dissertation, a sensitive method was applied to detect and systematically characterize rare myelin reactive CD4+ T cells directly ex vivo in the peripheral blood of healthy control subjects and MS patients. The method is based on the magnetic enrichment of specifically activated CD154+ T cells in combination with multiparametric flow cytometry.
The first part of the dissertation focused on the analysis of the frequency, phenotype and function of auto-reactive CD4+ T cells in healthy individuals. Subsequently, the focus was set on the comparative analysis of T cells specific for myelin basic protein (MBP ), myelin oligodendrocyte protein (MOG) and proteolipid protein (PLP) from MS patients and matched healthy control subjects.
CD4+ T cells with specificities for multiple sclerosis-, diabetes- and myasthenia gravis-associated antigens were detected in all healthy control subjects and are therefore part of a normal T cell repertoire. The frequency of myelin reactive T cells did not differ between MS patients and healthy control subjects. A distinct, but variable, quantity of autoantigen-specific T cells presented a memory phenotype (CD45RO+). Interestingly, the proportion of autoreactive memory T cells correlated with the proportion of memory T cells within the entire CD4+ T cell population in both cohorts. This association was also seen in neoantigen specific T cells. This observation does not support autoantigen induced clonal expansion of memory T cells and suggests an initial activation by a potential foreign antigen. In this regard, it was demonstrated that autoreactive T cells lines can cross-react with different randomly chosen microbial antigens, with memory-derived T cell lines predominantly reacting to viral antigens.
Autoantigen-specific memory T cells were able to produce inflammatory (TNF-α, IFN-γ, IL 17, GM-CSF) or B cell activating (IL-4, IL-21) cytokines. However, compared to the recall antigen Mannoprotein 65 (MP65) from Candida albicans, they revealed notably decreased antigen sensitivity. This indicates a restricted selection of autoreactive T cell clones with high affinity or, alternatively, a limited functional avidity maturation in the course of the immune response. In MS patients and healthy control subjects, only minimal functional differences within the myelin reactive memory T cells were found. A significantly increased proportion of memory T cells as well as CXCR3+/CCR6+ (Th1/Th17) cells in the myelin-specific repertoire in MS patients was also reflected in the total CD4+ T cell population. This finding is indicative of more general changes in the differentiation and functional state of CD4+ T cells in MS patients, rather than of an autoantigen-specific modulation.
In addition to myelin-specific conventional CD154+ T cells, autoreactive CD137+ regulatory T cells could be detected directly ex vivo in a small group of study subjects. This opens up new possibilities for the investigation of tolerance mechanisms at the antigen-specific level.
Conclusively, the ex vivo characterization of myelin specific T cells from the peripheral blood did not provide profound evidence of them being key players in MS. These results can in part explain the decreased efficacy of selective immune therapies in MS, which are mainly based on the immunopathological relevance of myelin specific CD4+ T cells in the animal model of MS (experimental autoimmune encephalomyelitis = EAE). The disease course in human is insufficiently presented in the EAE model. Therefore, the focus of research should more strongly be on finding relevant target antigens or alternative animal models and pathomechanisms in order to allow the development of new target-driven therapies. Future analyses should furthermore determine whether autoreactive T cells with low antigen sensitivity are able to contribute to the pathogenesis of autoimmune diseases.
