Etablierung eines dreidimensionalen Infektionsmodells für Kuhpockenviren in humaner Haut und Charakterisierung der Infektion
Neumann, Markus
Heutzutage stehen dreidimensionale Zellkulturmodelle für verschiedenste Anwendungen und Organe, z. B. die Haut, zur Verfügung. Für die Untersuchung viraler Infektionen bietet die Nutzung von 3D-Modellen eine wichtige physiologische Alternative, da die Organoide die Lücke zwischen Studien in klassischer 2D-Zellkultur und im Tiermodell schließen können. Im Rahmen dieser Studie werden die zoonotisch auftretenden Kuhpockenviren, als Vertreter der weitverbreiteten Pockenviren, untersucht. Diese replizieren in der Haut von Patienten und lösen dabei Läsionen aus.
Zum Aufbau des Modells wurde zunächst die Kultivierung differenzierter Hautäquivalente aus primären humanen Keratinozyten und Fibroblasten etabliert. Die Hautäquivalente wurden nach dem Aufbau zur Differenzierung bis zu drei Wochen im Airlift-Verfahren kultiviert. Dabei wurden die Proliferation, Apoptose und Zell-Zell-Interaktionen charakterisiert und eine in vivo-ähnliche Morphologie und Differenzierung nachgewiesen. Das etablierte 3D-Modell wurde zu einem Infektionsmodell für Kuhpockenviren ausgebaut und zur Untersuchung der viralen Replikation, Virus-Wirts-Interaktionen und zur Testung potenzieller Inhibitoren eingesetzt. Für die Infektion wurden die Äquivalente mit hohen infektiösen Dosen überschichtet und die gebildete Hornschicht mittels Impfnadel verletzt. Die Virusreplikation konnte vor allem in der Epidermis des Äquivalentes und dabei die Primärinfektion hauptsächlich im basalen Bereich nachgewiesen werden. Im Vergleich zur Infektion in 2D-Kulturen verlief die Replikation langsamer und führte zu geringeren maximalen Virustitern, weil in stark infizierten Äquivalenten noch uninfizierte Bereiche zu finden waren. Darüber hinaus war die Oberflächenstruktur der Virionen in 3D-Kultur gegenüber 2D-Kultur spezifisch modifiziert. Eine Transkriptomanalyse mittels RNA-Sequenzierung lieferte wertvolle, qualitativ hochwertige Daten der Genregulation für kuhpockenvirale Infektionen in 3D-Geweben. So waren insbesondere die Differenzierung, Wundheilung und cytoskelettale Proteine während der Infektion reguliert. Die Regulation konnte für ausgewählte Gene mittels qPCR, Western Blot und immunhistochemischen Analysen verifiziert werden. Dabei konnte insbesondere die Bedeutung des Mikrotubuli-assoziierten Proteins β-3 Tubulin während der Infektion im 3D-Modell belegt werden. Anhand von Dosis-Wirkungs-Kurven konnte die Nutzbarkeit des Modelles für Infektionsstudien dargelegt werden. Dabei zeigte die Infektion im 3D-Modell im Vergleich zum 2D-Modell eine höhere Sensitivität gegenüber dem verwendeten Hemmstoff Gefitinib, welcher sich potenziell auch für eine lokale Anwendung an Patienten im Rahmen eines Off-Label-Use eignen könnte.
Das etablierte Infektionsmodell ist so auf verschiedenen Gebieten der Forschung an Kuhpockenviren eine wertvolle, physiologische Ergänzung zu den bestehenden Modellen basierend auf 2D-Zellkultur und Tierversuchen. Das Hautmodell kann in Zukunft auch für andere Viren ein wertvolles Werkzeug zum besseren Verständnis der Pathogenese und zur Entwicklung antiviraler Therapien sein.
Three-dimensional cell culture models are well-established for different applications and organs, such as human skin. These 3D models can facilitate the examination of viral infections in a more physiological manner, thus bridging the gap between studies in classical 2D culture and animal experiments. Within the scope of this thesis, the zoonotic Cowpox virus was examined, as it replicates in the skin of patients causing characteristic lesions.
To develop the 3D model, cultivation of differentiated skin equivalents composed of primary human keratinocytes and fibroblast was established. For differentiation, equivalents were cultivated in airlift mode for up to three weeks. Proliferation, apoptosis and cell-cell-interaction were characterized. Equivalents showed an in vivo-like morphology and differentiation. The established 3D skin model was developed into an infection model for Cowpox virus to examine viral replication, virus-host interactions and potential inhibitors. Infection of equivalents was carried out with high infectious doses via puncturing the outer horny layer with a bifurcated needle to overcome the epidermal barrier. Cowpox virus replication was mainly seen in the epidermal part, whereas primary infection was located in the basal part of the epidermis. Virus replication in 3D was slower compared to 2D culture and yielded less infectious particles due to still remaining uninfected areas in highly infected equivalents. The surface of virus particles was specifically modified in 3D culture. The RNA-Seq-based transcriptome analysis generated high-quality data for examination of the regulation of gene expression by Cowpox virus in this 3D system. Differentiation, wound healing and genes of cytoskeleton proteins were regulated during infection. Gene regulation was confirmed via qPCR analysis, Western Blotting and immunohistochemistry. In particular, the microtubule-associated protein tubulin β-3 was highly regulated during infection especially in skin equivalents. Inhibition studies were carried out with Gefitinib showing higher sensitivity of CPXV infection towards the inhibitor in 3D culture compared to 2D culture. Therefore Gefitinib might be a promising candidate for an off-label use against local CPXV infections in patient skin.
The established infection model has proven to be a valuable, physiological alternative to study Cowpox viruses. This skin model may also be adapted to other viruses to promote the understanding of viral pathogenesis and the development of new antiviral therapies.
