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RNA-Interferenz-basierte Therapien bei Adenovirusinfektionen im immunsupprimierten Wirt
Schaar, Katrin
Infektionen mit humanen Adenoviren verlaufen meist mild und sind nach wenigen Wochen auskuriert. Vor allem die oberen Atemwege sind betroffen, abhängig vom Serotypen können sich auch andere Symptome ergeben. Liegt eine weitere Erkrankung vor, die mit einer natürlichen oder pharmakolo-gisch induzierten Schwächung des Immunsystems einhergeht, z.B. nach Transplantationsprozeduren, verlaufen die Erkrankungen schwerer, Infektionen können disseminieren und das Risiko, an Multior-ganversagen zu sterben, erhöht sich drastisch. Derzeit existiert keine Standardtherapie und die emp-fohlene Verabreichung von Nukleosidanaloga, intensivmedizinischer Betreuung und Palliativmedizin stellt keine befriedigende Option für die Betroffenen dar. Zwei besonders Erfolg versprechende An-sätze befinden sich noch in der Phase der Erforschung. Das Nukleotidanalogon Brincidofovir (BCV) durchlief kürzlich eine Phase-III-Studie, die zu positiven Ergebnissen kam. Sprachen Patienten binnen kurzer Zeit auf die Behandlung an, war die Wahrscheinlichkeit groß, dass sie die Infektion überwinden konnten. In der Gruppe der Non-Responder waren weiterhin zahlreiche Todesfälle zu verzeichnen. Dar-über hinaus wurden sehr eindrucksvolle Studien mit allogenen T-Zell-Spenden präsentiert. T-Zellen wurden von Spendern isoliert, ex vivo für Adenovirus-Epitope geprimt und expandiert. Anschließend wurden sie dem Patienten infundiert. Mit Hilfe dieses Ansatzes war es möglich, teilweise multiple In-fektionen verschiedener Viren gleichzeitig erfolgreich zu behandeln. Auch hier gab es kein vollständi-ges Ansprechen aller eingeschlossenen Patienten auf die Therapie, unter den Respondern waren die Aussichten auf Heilung sehr gut. Bemühungen, die Verfügbarkeit der T-Zellen als „Off-the-shelf-Pro-dukte“ zu erhöhen, sowie die Produktionszeiträume und –kosten zu senken, werden intensiv verfolgt. In einem anderen Ansatz wurde das Prinzip der RNA Interferenz ausgenutzt, um die virale Replikation zu unterbinden. Spezifische siRNAs wurden entwickelt, die ihre Zielsequenz in den mRNAs verschiede-ner, essentieller, viraler Gene hatten. Bei Anwesenheit von mRNA und siRNA, wurde die Translation des viralen Proteins inhibiert, indem die mRNA abgebaut wurde. Erste in vitro-Studien unterstrichen das hohe Potential des Ansatzes. Besonders auffällig war die Inhibierung der Replikation von hAd5 durch den Einsatz von sechs miteinander verketteten Expressionsumgebungen einer amiR, die die Ex-pression von pTP regulierte. Mit Hilfe eines adenoviralen Vektors konnte die Bildung neuer Virionen in vitro um 97,6 % vermindert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden publizierte siRNA-, shRNA- oder amiR-Sequenzen zum Teil minimal verändert, um mit Hilfe der Expressionsumgebung der natürlichen miR-155 bereitgestellt werden zu können. Neun verschiedene amiRs mit Zielsequenzen in den mRNAs von fünf viralen Genen wurden erstellt und ihr Potential zur Inhibierung der Adenovirus-Replikation untersucht. Nach eingehender Analyse der Vektoren mit einer Kopie einer amiR-Expressionsumgebung wurden diverse Kombinati-onsvektoren erstellt, die gleichzeitig amiRs gegen pTP und / oder E1A exprimierten. Zwei der unter-schiedlich konfigurierten Vektoren erwiesen sich als ähnlich hilfreich in Hinblick auf die Verringerung der Virusreplikation und der Verbesserung der Viabilität infizierter Zellen. Der eine Vektor entsprach weitestgehend dem von Ibrisimovic et al. vorgestellten, welcher sechs Kopien der amiR-pTP expri-mierte. Die amiR-pTP wurde aus dieser Arbeit übernommen und war auch nach Expression von scAAV2-Vektoren, statt von adenoviralen Vektoren, weiterhin sehr effizient. Der andere Vektor expri-mierte neben drei Kopien amiR-pTP noch drei weitere Kopien amiR-E1A_2. Sowohl hinsichtlich der Virusreplikation als auch der Viabilität unterschieden sich die Ergebnisse der beiden Vektoren nicht signifikant voneinander. Sie wurden ausgewählt, in einem immunsupprimierten, permissiven Tiermo-dell auf ihr Potential zur Virusinhibierung untersucht zu werden. An Hand der verfügbaren Daten aus der Literatur wurde ein Modell Syrischer Hamster entwickelt, wel-che pharmakologisch immunsupprimiert wurden. Sie wurden prophylaktisch mit scAAV2/9-amiR-Ad (6x) transduziert und eine Woche später mit hAd5 infiziert. Analysen zeigten eine disseminierte Infek-tion mit replizierenden Viren in Serum, Leber, Herz und in geringen Mengen in der Milz. Der Gewebe-schaden war sehr gering, ca. 5 – 10 % der Leberzellen waren infiziert. Daraus resultierend waren keine gewebetoxischen Effekte zu beobachten. Durch den Einsatz beider amiR-Ad-Vektoren wurde die In-fektion auf ein Maß reduziert, das als klinisch unbedenklich betrachtet wird. Ähnlich wie schon in den in vitro-Studien konnten nur wenige Unterschiede zwischen den beiden Vektoren gefunden werden. Einzig die immunhistologischen Schnitte legten eine stärkere Wirkung des Vektors nahe, der sowohl amiR-pTP als auch amiR-E1A_2 exprimierte. Es konnte also experimentell belegt werden, dass drei Ex-pressionsumgebungen von amiR-pTP kombiniert mit drei weiteren für amiR-E1A_2 eine Verringerung der Virusinfektion induzierten, die in Bezug auf die Reduktion von Virusnachkommen in Leber und Se-rum, der Reduktion viraler DNA in der Leber und auch in der Bewertung der pathologischen Gewebe-schäden die größten Verbesserungen gegenüber nicht behandelten Kontrollen zeigten. Die signifikante Verringerung der Infektion kann zukünftig beispielsweise durch die Kombination mit anderen therapeutischen Ansätzen. So würde eine hAd5-Infektion auf mehreren Ebenen attackiert. Bereits vor dem Zelleintritt könnten mit Hilfe einer löslichen Virusrezeptorfalle Viruspartikel gebunden werden, welche dann nicht mehr für eine Infektion zur Verfügung stünden. Gemeinsam mit der Re-duktion der Replikation der verbliebenen Viren durch amiR-Ad-induzierte RNAi würde der Effekt ide-alerweise stärker reduziert als durch die Einzelkomponenten allein. Beide Therapien zeichneten sich tierexperimentell durch die Abwesenheit von Nebenwirkungen aus. Im Bereich der Behandlungen, die bereits stärker erforscht worden sind – BCV und T-Zell-Transplanta-tion, sind enorme Fortschritte gemacht worden. Beide Ansätze zeigten aber Lücken, wiesen Patienten-gruppen aus, die darauf nicht ansprachen, und waren z.T. mit Nebenwirkungen verbunden, die ihrer-seits schwerwiegende Konsequenzen darstellten. Mit der Erforschung der antiviralen RNAi wird ein weiterer konsequenter Schritt in die Richtung einer gut verträglichen Therapie mit breiter Anwen-dungsbasis unternommen. Das Wirkprinzip konnte in dieser Studie eindrucksvoll demonstriert wer-den, viele weitere Aspekte können in zukünftigen näher beleuchtet werden, um sowohl das Tiermodell zu verbessern als auch die Möglichkeiten der Anwendung von Kombinationstherapien zu erforschen.
Human Adenoviruses usually cause mild infections and are cleared by the immune system within a few weeks. In most cases, the upper respiratory tract is affected; depending on the serotype other symp-toms may additionally occur. In presence of another disease that causes a depletion of the immune system, e.g. after transplantation procedures, infections can cause more serious symptoms, spread over the body, and the risk to die from multi-organ failure increases drastically. These days, there is no agreement on a standard therapy, while the recommended administration of nucleotide analogs, hos-pitalization in intensive care units and palliative care do not present a satisfying option. Two rather promising approaches are still being tested. The nucleotide analog Brincidofovir (BCV) was recently evaluated in phase III clinical trial. First positive results were published stating a high probability for virus clearance if the patient quickly responded to therapy. Among the non-responders several deaths occurred due to the infections, whereas deaths among responders were usually due to other causes. Impressing studies exploiting allogenic T-cell transplantation were presented as well. T-cells were iso-lated from donors, primed and expanded ex vivo, and finally infused to infected patients. Using this approach, multiple concomitant virus infections could be treated at the same time. However, there were patients who did not respond to the therapy, whereas among the responders chances for com-plete clearance of the infection were very good. These days, measurements are taken to reduce time and costs of production and to facilitate T-cells as “off the shelf” therapy. Viral infections can also be inhibited based on the principle of RNAi. Sequence-specific siRNAs finding their target sites within different crucial viral mRNAs have been developed. In presence of both, mRNA and siRNA, the translation of the viral protein is inhibited by degradation of the mRNA. Several in-vitro studies underlined the efficacy of that approach. Especially remarkable was the inhibition of hAd5 rep-lication by concatemerization of six expression cassettes of an amiR targeting pTP. Using an adenoviral vector assembly of new virions could be inhibited by 97.6 %. In this study, the published sequences of anti-adenoviral siRNAs, shRNAs or amiRs were altered to fit the amiR-expression cluster mimicking the natural environment of miR-155. Nine different amiRs were designed to find their respective target sites in the mRNAs of five adenoviral mRNAs, and their poten-tial to inhibit viral replication was evaluated. After careful analysis of the efficacy of single-copy amiR-vectors combinations of amiR-expression clusters were designed to enhance the efficiency. The new vectors expressed amiR-pTP and / or amiR-E1A_2 concomitantly; they differed in their respective con-figuration of expression cassettes. Two of them proved exceptionally potency regarding inhibition of virus replication and improvement of cell viability of infected cultures. One of them contained six cop-ies of amiR-pTP as published by Ibrisimovic et al.; the other expressed three copies of amiR-pTP and another three of amiR-E1A_2. The results obtained from both vectors never showed statistically sig-nificant differences between each other. They were chosen to be evaluated for their inhibition capa-bility in an immunosuppressed, permissive animal model.
According to literature data, a Syrian hamster model was established. Concomitant to pharmacologic suppression of the immune system, they were transduced with scAAV2/9-amiR Ad (6x), and two weeks thereafter infected with hAd5. Analyses showed a disseminated infection with replicating particles in serum, liver, heart and spleen one week p.i. The pathologic damage of liver tissue was minor, as only 5 – 10 % of the cells were infected resulting in no visible toxic effects on the tissue. The administration of either one of the two vectors reduced the infection to a level that is considered clinically unremark-able. Similar to the in vitro-experiments, the differences in between the vectors were negligible, except for the immunohistochemistry, in which the vector targeting pTP and E1A performed slightly better. These results suggest that the combination of three expression cassettes of amiR-pTP and amiR-E1A_2 induced an inhibition of hAd5-infection detectable on the level of virus titer in liver and serum, viral DNA in and histopathologic assessment of liver tissue was superior to the treatment with the previ-ously published vector target pTP, exclusively. The proposed therapy may be combined with others, e.g. the virus receptor trap sCar, resulting in an attack on the infection on multiple levels. The receptor trap prevents viruses from cell entry by binding the cell attachment receptors and presenting them to immune cells via its Fc portion. Given the addi-tional reduction of virus replication based on RNAi, the effect on virus replication and infection treat-ment might ideally be higher than caused by single approach treatments. In addition to their high effi-cacy, both therapies did not induce adverse events during animal trials. Among the more researched treatments using BCV or T-cells, enormous progress has been made. On the other hand, both approaches could not be presented to be flawless. There were patients not re-sponding during clinical trials, and sometimes adverse events occurred, presenting serious problems themselves. Further investigation of RNAi as a potential antiviral therapy is another important step towards a well tolerable therapy with a broad spectrum of applications. This study serves as a proof-of-principle examination of the potential of antiviral RNAi in vivo; many more aspects should be scope of future projects improving the underlying animal model as well as the potential implementation of combined therapies.
