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IR spectro-electrochemistry of an adsorbed oxygen-tolerant [NiFe] hydrogenase on conductive surfaces
Heidary, Nina
Hydrogenases are metalloenzymes, catalyzing the reversible oxidation of molecular hydrogen into two protons and two electrons. The 'Knallgasbacterium' Ralstonia eutropha H16 (Re) is one of the few examples, harboring several [NiFe] hydrogenases that established mechanisms to enable catalytic conversion of H2 in the presence of O2. In order to exploit the catalytic potential of these oxygen-tolerant hydrogenases, also in view of possible biotechnological applications in biofuel cells, an efficient electronic communication between the enzyme and electrically conducting surface is required. Hence, for optimum performance, an in-depth understanding of the enzyme-surface interactions is needed. This thesis presents an interdisciplinary approach providing detailed insights into the adsorption parameters of heterodimeric membrane-bound [NiFe] hydrogenase (MBH) species of Re on various electrode materials. The first part was dedicated to adsorption studies of oxygen-tolerant MBH on biocompatibly coated Au electrodes by protein film voltammetry (PFV), surface enhanced IR absorption (SEIRA) spectro-electrochemistry, atomic force microscopy (AFM), and ellipsometry in order to elucidate the enzymes catalytic activity, structure, integrity, and surface coverage. Results were obtained for charged and hydrophobic surfaces. Electrocatalytic efficiencies correlated with the mode of protein adsorption on the electrode provided valuable insights in the orientational configuration, which were complemented with molecular dynamics (MD) simulations as well as density functional theory (DFT) calculations, carried out in collaboration. Hence, proposed orientational configurations provided by different accessible binding anchors of the MBH were discussed and experimentally verified by SEIRA spectro-electrochemical investigations. The obtained results suggested that, in particular, an immobilization of heterodimeric MBH on slightly negatively charged surfaces was most beneficial for an efficient interfacial electron transfer (ET). Hereby, the suggested anchoring via the isolated transmembrane helix still allowed a flexibility regarding rotational and translational motions of the large protein backbone elative to the surface. This led to an effective orientation, enabling solely direct ET of the adsorbed active enzymes. In general, applied potentials revealed reorientations under preservation of the enzyme’s initial binding anchors. In addition, redox changes at the active site of MBH bound on a positively charged biocompatible Au electrode were investigated under turnover conditions as well as under the influence of applied potentials. The second part of this thesis introduced a novel in situ IR spectro-electrochemical approach to monitor protein adsorption on two different transparent conductive oxide (TCO) materials, i.e. antimony-doped tin oxide (ATO) and tin-rich indium oxide (ITOTR). Using horse heart cytochrome c (cyt c) as a model system, protein adsorption on planar ATO and ITOTR thin film electrodes was monitored spectroscopically. Within these studies, a selective protein binding via a histidine affinity tag (His-tag) to the unmodified metal oxide surfaces of ATO and ITOTR was shown. Using the advantage of a controlled immobilization via this affinity tag, Re His-tagged MBH (his-MBH) was directly adsorbed onto ITOTR and also studied in situ by an attenuated total reflection IR (ATR-IR) spectro-electrochemical approach, thereby demonstrating the integrity of the adsorbed protein. Simultaneous PFV studies revealed a remarkable bi-directional activity for H2 cleavage and formation of his-MBH on ITOTR. The latter effect may be related to the specific semiconductor-enzyme interactions, which were discussed in comparison to the unspecific bound Re strep-tagged MBH on the electrode material. Finally, ATR and SEIRA measurements of cyt c and both MBH variants were compared with respect to the signal enhancement, which eventually allowed for an estimation of the catalytic activity of MBH species on different surfaces.
Hydrogenasen sind Metalloenzyme, die reversibel die Oxidation von molekularem Wasserstoff in Protonen und Elektronen katalysieren. Das ”Knallgasbakterium“ Ralstonia eutropha H16 (Re) ist eines der wenigen Beispiele, das mehrere [NiFe] Hydrogenasen besitzt, welche Mechanismen der katalytischen H2-Umsetzung unter atmosphärischem Sauerstoffgehalt entwickelt haben. Um das katalytische Potential dieser Sauerstoff-toleranten Hydrogenasen zu erschliessen, insbesondere hinsichtlich möglicher biotechnologischer Anwendungen in biologischen Brennstoffzellen, ist eine effiziente elektronische Kommunikation zwischen Enzym und leitfähiger Oberfläche erforderlich. Dies bedingt ein tiefgreifendes Verständnis der Enzym-Oberflächen-Interaktionen. In dieser Arbeit wurde ein interdisziplinärer Ansatz vorgestellt, der detaillierte Einblicke in die involvierten Adsorptionsparamater der heterodimeren membrangebundenen [NiFe] Hydrogenase (MBH) aus Re auf verschiedenen Elektrodenmaterialien ermöglicht. Der erste Teil dieser Arbeit ist der Adsorptionsstudie der sauerstofftoleranten MBH auf biokompatibel beschichteten Goldelektroden gwidmet. Anhand der Proteinfilm-Voltammetrie (PFV), der Oberflächenverstärkte Infrarot-Absorptions (SEIRA) Spektroelektrochemie Rasterkraftmikroskopie (AFM) und Ellipsometrie wurden die katalytische Aktivität des Enzyms, sowie dessen Struktur, Integrität und Oberflächenbeladung untersucht. Hierfür wurden Resultate der MBH auf geladenen und hydrophoben Oberflächen erhalten. Die Korrelation zwischen der elektrokatalytischen Effizienz und der Art der Oberflächenanbindung des Enzyms auf der Elektrode lieferte wertvolle Informationen zur Orientierung des Enzymes. Die experimentellen Daten wurden durch Molekular-Simulationen und Berechnungen von IR-Spektren mit Hilfe der Dichtefunktionaltheorie (DFT) komplementiert, die in Kooperation durchgeführt wurden. Die vorgeschlagenen Orientierungskonfigurationen, welche auf unterschiedlichen zugänglichen Bindungsankern an der MBH basieren, wurden diskutiert und konnten mittels einer SEIRA-spektroelektrochemischen Studie experimentell nachgewiesen werden. Die so erhaltenen Ergebnisse schlagen insbesondere für eine Immobilizierung der heterodimeren MBH auf leicht negativ geladenen Oberflächen einen optimierten Elektronentransfer an der Enzym-Elektroden-Grenzfläche vor. Hierbei wird eine Immobilisierung der MBH über ihre isolierte Transmembran-Helix angenommen, die über diese Anbindung auch eine Flexibilität des Proteingerüsts hinsichtlich Rotations- als auch Translationsbewegungen relativ zur Oberfläche erlaubt. Dies führt zu einer vorteilhaften Orientierung, die einen direkten Elektronentransfer aller adsorbierten und aktiven Enzyme ermöglicht. Angelegte Elektrodenpotentiale führten teilweise zu Reorientierungen bei Erhalt der ursprünglichen Bindungsanker zwischen Enzym- und Elektrodenoberfläche. Zusätzlich konnten auch Änderungen der Redoxzustände des aktiven Zentrums der MBH unter Turnover-Bedingungen sowie unter dem Einfluss angelegter Potentiale untersucht werden. Der zweite Teil dieser Arbeit führte einen neuen in situ IR spektroelektrochemischen Ansatz zur Beobachtung der Proteinadsorption auf zwei unterschiedlichen, transparenten und leitfähigen Oxidmaterialen (TCO) ein, Antimon-dotiertes Zinn Oxid (ATO) und zinnreiches Indium Oxid (ITOTR). Unter Verwendung von Pferdeherz-Cytochrome c (cyt c) als Modelsystem wurde die Proteinadsorption auf planaren ATO- und ITOTR-Dünnschichtelektroden spektroskopisch verfolgt. In diesem Zusammenhang konnte eine selektive Proteinanbindung über einen Histidin-Affinitätstag (His-tag) an der isolierten Transmembran-Helixauf unmodifizierten Metalloxid-Oberflächen nachgewiesen werden. Diese Art der Anbindung wurde genutzt, um His-getaggte MBH (His-MBH) von Re direkt an die ITOTR Elektroden anzubinden und mittels eines in situ ATR-IR-spektroelektrochemischen Anzatzes zu untersuchen. Hierdurch konnte sowohl der Erhalt der Sekundärstruktur wie auch der strukturellen Integrität des aktiven Zentrums an der Oberfläche demonstriert werden. Simultan ausgeführte PFV-Studien von his-MBH auf ITOTR wiesen eine erstaunliche bi-direktionale Aktivität zur H2-Oxidation und -Reduktion auf. Die ungewöhnliche H2-Reduktion der His-MBH wurde auf spezifische Halbleiter-Enzym-Interaktionen zurückgeführt, welche im Zusammenhang mit der unspezifisch gebundenen streptag MBH auf ITOTR diskutiert wurden. Zum Abschluß wurden Ergebnisse der ATR-IR und SEIRA Spektroskopie von cyt c und beiden MBH Varianten hinsichtlich der Signalverstärkung verglichen und letztendlich eine Abschätzung der katalytischen Aktivität der MBH auf verschiedenen Oberflächen durchgeführt.
hydrogenasesurfacebiocatalysisenzyme adsorptionSurface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy (SEIRA)Transparent Conductive Oxide (TCO)material-enzyme interactionHydrogenaseOberflächeBiokatalyseEnzymadsorptionoberflächenverstärkte Infrarot-Absorptionsspektroskopietransparente elektrisch leitfähige Oxide
