Development of eukaryotic cell-free systems based on Chinese hamster ovary cells for the production of "difficult-to-express" proteins
Thoring, Lena
Nowadays, recombinant protein production plays a pivotal role for the manufacturing of biopharmaceuticals. A variety of in vivo production systems are available originating from eukaryotic and prokaryotic hosts, whereby Chinese Hamster Ovary cells (CHO cells) are one of the main production cell line for complex, mammalian proteins. Limitations of cell based protein production systems are often observed in conjunction with the synthesis of special protein classes also termed as “difficult-to-express” proteins including the pharmaceutical relevant class of membrane proteins. To circumvent the issues of in vivo production platforms cell-free protein synthesis systems are continuously developed based on cell lysates harboring no cellular maintenance metabolism while containing the complete translational machinery. Special eukaryotic cell-free systems are developed harboring endogenous microsomes derived from the endoplasmic reticulum enabling protein translocation, posttranslational modification of proteins and the direct embedding of membrane proteins in a nature like milieu. This work addresses the combination of the main mammalian production host CHO cells with a cell-free system to obtain a versatile mammalian cell-free system related to the industrial Protein production of biopharmaceuticals. This study is divided into four main parts, while part 1, 2 and 3 are based on DNA templates containing an internal ribosomal entry site of the intergenic region of cricket paralysis virus (CRPV IGR IRES) for cap-independent translation initiation. In the first section, a deeper look was taken into the preparation of CHO cell lysate addressing the production of increased amounts of translationally active CHO cell lysate in particular. Adaptation of cell cultivation conditions, evaluation of cell disruption procedures and adjustment of lysate reconditioning led to the possibility to scale-up cell lysate preparation and thereby decrease process costs. Secondly, the versatility of batch-formatted cell-free reactions was evaluated concerning the DNA template applicability and the production of diverse types of “difficult-to-express” proteins including the secreted protein hBMP2. Various Plasmid backbones and linear DNA templates can be applied to the CHO cell-free system leading to the possibility of fast and efficient DNA template production. Apart from the batch-formatted cell-free reaction, a novel high productive cell-free system was developed based on the combination of a continuous exchange reaction device and the translationally active CHO cell lysate. Optimization of reaction conditions led to protein yields up to around 1 g/l of membrane protein EGFR, whereby protein activity and glyco modifications were detected. Additionally, the production of a single chain variable fragment and the ion channel KvAP in the optimized CHO CECF system resulted in high protein yields, whereby functionality of cell-free synthesized proteins was proved. Finally, the applied CHO cell-free system was refined to enable cap-dependent translation initiation. The bottleneck in cap-dependent translation initiation was verified by the analysis of translation factors and regulators, whereby the phosphorylation of eIF2α showed the main inhibitory effect. The application of specific small molecule Inhibitors led to the activation of cap-dependent translation initiation. In summary, the obtained results demonstrate the versatility of the CHO cell-free system and the high potential for future industrial applications, in the context of the production of “difficult-to-express” proteins. The CHO cell-free platform shows a high potential for the development of fast and efficient novel screening technologies to improve drug development.
Die rekombinante Proteinherstellung ist ein Schlüsselprinzip in der pharmazeutischen Industrie zur Herstellung von Therapeutika und basiert auf speziell modifizierten prokaryotischen und eukaryotischen Zellen. Häufig wird eine immortalisierte Zelllinie aus Ovarien des Chinesischen Zwerghamsters, kurz CHO Zellen genannt, für die Produktion von komplexen Säugetierproteinen verwendet. Limitierungen von zellbasierten Produktionssystemen treten auf, wenn das rekombinante Protein zytotoxisch auf die Zelle wirkt oder durch hydrophobe Wechselwirkung dazu tendiert, in der Zelle zu aggregieren. Diese sogenannten „schwer exprimierbaren Proteine“ beinhalten beispielsweise die pharmazeutisch relevante Klasse der Membranproteine, welche in die Entwicklung zahlreicher Erkrankungen involviert sind. Um die Produktion dieser Proteintypen zu ermöglichen, wurden neuartige zellfreie Proteinsynthesesysteme entwickelt, die auf Zelllysaten anstelle von kompletten Zellen beruhen. Besondere zellfreie Systeme, basierend auf eukaryotischen Zelllysaten, beinhalten endogene Mikrosomen, die während des Zellaufschlusses aus dem Endoplasmatischen Retikulum (ER) erhalten werden. Diese Mikrosomen ermöglichen eine Translokation von Proteinen in das Lumen des ERs, posttranslationale Modifikationen und eine direkte Integration von Membranproteinen in eine natürliche Umgebung. In dieser Arbeit wurde die Entwicklung neuartiger zellfreier Systeme adressiert, die die CHO Produktionszelllinie mit einem zellfreien Proteinsynthesesystem kombiniert. Generell wurden vier Hauptthematiken betrachtet, die zur Optimierung und Evaluierung des Systems führten, wobei Punkt 1-3 eine CRPV IGR IRES DNA Matrizen für Cap unabhängige Translationsinitiation als Grundlage für die Proteinproduktion verwendeten. Der erste Bereich umfasste die nähere Betrachtung der Herstellung von translationsaktiven CHO Lysaten, wobei ein Fokus auf die Hochskalierung der Lysatproduktion sowie auf Kultivierungs- und Aufarbeitungsparameter gelegt wurde, um große Mengen an Lysat für potentielle industrielle Applikationen zu produzieren. Um dies zu realisieren, wurde der Zellkultivierungsmodus von der generellen Batchfermentation auf eine Perfusionsfermentation übertragen und Aufschluss- und Aufarbeitungsbedingungen adaptiert. Neben der Herstellung der Lysate wurde das Batch basierte zellfreie Proteinsynthesesystem auf die vielseitige Einsetzbarkeit überprüft, um eine Grundlage für industrielle Applikationen zu bietet. Nicht nur die Synthese von verschiedenen schwer exprimierbaren Proteine, wie beispielsweise hBMP2, wurde gezeigt, sondern auch die Verwendbarkeit von unterschiedlichen Expressionsplasmiden und linearen PCR Produkten. Das bestehende Batch basierte zellfreie Proteinproduktionssystem wurde im dritten Teil der Arbeit zu einer hochproduktiven Plattform weiterentwickelt, die auf einer Kombination aus einem kontinuierlichen Austauschreaktor und den translationsaktiven CHO Lysaten beruht. In diesem sogenannten CHO CECF System wurden nach Optimierungen der Reaktionsparameter Proteinerträge von bis zu circa 1 g/l des Membranproteins EGFR erhalten, bei welchem Aktivität und Glykomodifikationen nachgewiesen werden konnten. Des Weiteren führte die Produktion von einem Antikörperfragment und dem Ionenkanal KvAP zu hohen Proteinerträgen, wobei Funktionalität nachgewiesen werden konnte. Als letzten wurde die Cap abhängige Translationsinitiation im zellfreien CHO System analysiert, da dieses zu sehr limitierten Proteinerträgen führt. Eine nähere Betrachtung der Aktivität von Translationsfaktoren und –regulatoren zeigte, dass Initiationsfaktor eIF2α in seiner inaktiven, phosphorylierten Variante vorhanden ist. Eine weitere Analyse von spezifischen Inhibitoren, führte zur erfolgreichen Aktivierung der Cap abhängigen Translationsinitiationen, was die vielfältige Anwendbarkeit weiter expandiert. Zusammenfassend demonstrieren die aufgezeigten Ergebnisse die vielseitige Anwendbarkeit der entwickelten CHO zellfreien Systeme und das hohe Potential für zukünftige industrielle Anwendungen mit besonderem Fokus auf die Produktion schwer exprimierbarer Proteine. Die zellfreie Plattform basierend auf CHO Zellen bietet die Möglichkeit der Entwicklung von schnellen und effizienten Screeningtechnologien, um die Entwicklung von Therapeutika zukünftig zu verbessern.
