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Investigation of membrane-active peptides and proteins by vibrational spectroscopy
Forbrig, Enrico
The plasma membrane acts as the barrier and interface between the intracellular compartment and the extracellular environment. There are a variety of physical and chemical stimuli that are transmitted over the plasma membrane by means of integrated biomolecules, e.g. membrane proteins and peptides. To elucidate such processes in more detail, the development of artificial biomimetic membrane systems has been a focus during the last decades. In this work, the multiple mechanisms of interactions between peptides and proteins with membranes have been investigated by utilizing a previously established tethered bilayer lipid membrane (tBLM) system. This tBLM was assembled on a nanostructured gold electrode and surface-enhanced infrared (SEIRA) spectroscopy was applied under control of electrical potentials to mimic the transmembrane potential. Antimicrobial peptides (AMPs), synthesized by a wide range of organisms, target and disrupt the negatively charged bacterial cell membrane due to their positive charge. However, the exact mode of action of AMPs still remains elusive. The development of resistances against antibiotics becomes a major issue in the clinical treatment of bacterial infections, making AMPs interesting targets of study. The human AMP LL-37 as well as its mutated fragments LL-32 and LL-20 were analysed using a tBLM comprised of 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) and 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol) (POPG). To obtain information about the secondary structure of these peptides in solution IR measurements were conducted. The analysis of the peptide backbone amide modes revealed an a-helical structure of all peptides. The same result was obtained by molecular dynamics (MD) simulations of the peptides in solution. Based on the surface-selection rules and the distance dependence of SEIRA, the orientation and location of the peptides within the tBLM was determined.
These measurements revealed that LL-37 incorporates horizontally with its N-terminus into the hydrophobic core of the membrane, whereas LL-32 adsorbs horizontally onto the hydrophilic headgroups and LL-20 does not interact with the system. The same conclusion was drawn from MD simulations of 300 ns, in agreement with the previously described importance of the amino acid residues 17 - 29 for the peptide function, since LL-20 lacks this region. The AMP alamethicin (ALM), comprised of a N-terminal a-helix and C-terminal 3-10 -helix, interacts with bacterial membranes in response to the transmembrane potential. The conducted voltage-dependent SEIRA study, using a tBLM composed of POPC:POPG, was combined with density functional theory (DFT) calculations resulting in the development of a kinetic integration model of ALM. After its adsorption on the bilayer surface the peptide incorporates via its N-terminus. This leads to a reorientation with respect to the surface normal, between 78° - 69° in the horizontally adsorbed state to 21° in the transmembrane-incorporated state. The bacterial Complex I (CpI) couples the electron transfer between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and ubiquinone resulting in their respective oxidation and reduction. This process allows the transmembrane translocation of protons, making CpI an essential membrane protein in the energy production of bacterial cells. CpI was incorporated into a supported lipid membrane system based on a (de)protonable 4-aminothiophenol (4-ATP) SAM, POPC:POPA phospholipids and a quinone. 4-ATP serves not only as linker molecule to a nanostructured gold-surface but also as pH sensor, as indicated by concomitant DFT calculations. In this way, the transmembrane proton translocation was observable via the protonation state of 4-ATP depending on the net orientation of CpI molecules induced by two complementary approaches. An associated change of the amide I/amide II band intensity ratio indicates conformational modifications upon catalysis which may involve movements of transmembrane helices or other secondary structural elements as suggested in literature.
Die Plasmamembran fungiert als äußere Grenzschicht und Schnittstelle zwischen dem intrazellulären Kompartiment und der extrazellulären Umgebung. Integrierte Biomoleküle, wie z.B. Proteine und Peptide, übertragen unterschiedliche physikalische und chemische Reize an der Plasmamembran. Die Entwicklung künstlicher biomimetischer Membransysteme ermöglicht die Aufklärung dieser Prozesse. In dieser Arbeit werden trägerfixierte Lipiddoppelschichtmembranen (tethered bilayer lipid membrane – tBLM) genutzt, um die Interaktionsmechanismen von Peptiden sowie Proteinen mit Membranen zu untersuchen. Es wurde eine tBLM auf einer nanostrukturierten Goldelektrode aufgebaut und die oberflächenverstärkte Infrarot-Spektroskopie (surface-enhanced irfrared absorption - SEIRA) wurde unter Kontrolle des elektrischen Potentials zur Nachbildung des Transmembranpotentials angewendet. Die rasante Entwicklung antibiotikaresistenter Bakterienstämme stellt eine wachsende Herausforderung für die Behandlung von Infektionen dar. Antimikrobielle Peptide (AMP), hergestellt durch eine Vielzahl an Organismen, wirken aufgrund ihrer positiven Ladung destruktiv auf die negativ geladene Bakterienmembran, wobei der genaue Wirkmechanismus nicht abschließend geklärt ist. Das humane AMP LL-37 und dessen synthetisch hergestellte Fragmente LL-32 und LL-20 wurden mit Hilfe einer tBLM, welche aus 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) und 1-palmitoyl-2oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1’-rac-glycerol) (POPG) besteht, analysiert. Mit Hilfe von IR-Messungen wurde die Sekundärstruktur in Lösung ermittelt. Die Analyse der Amid-Banden des Peptidrückgrats ergab für alle Peptide eine a-helikale Struktur. Molekulardynamische (MD) Simulationen der Peptide in Lösung bestätigten dieses Ergebnis.
Auf Grundlage der Oberflächenauswahlregeln und Abstandsabhängigkeit von SEIRA wurde die Orientierung und Lage der Peptide innerhalb der tBLM bestimmt. LL-37 inkorporierte horizontal mit dem N-Terminus in den hydrophoben Membranteil, LL-32 adsorbierte horizontal auf der hydrophilen Membranaußenseite, während LL-20 nicht mit dem System interagierte. Dieselbe Schlussfolgerung wurde aus MD Simulationen (300ns) gezogen, welche die zuvor beschriebene Bedeutung der Aminosäurereste 17-29 für die antimikrobielle Aktivität des LL-37 bestätigen. Diese Sequenz ist im Fall von LL-20 nicht intakt. Das AMP Alamethicin (ALM), aufgebaut aus einem a-helikalen N-Terminus und einer C-terminalen 3-10 -Helix, interagiert in Abhängigkeit des Transmembranpotentials mit Bakterienmembranen. Unter Nutzung einer tBLM (POPC:POPG) wurde eine potentialabhängige SEIRA-Studie mit Dichtefunktionstheorie (DFT) Rechnungen kombiniert, um ein kinetisches Model der Integration von ALM in Membranen zu beschreiben. Das Peptid inkorporiert nach Adsorption mit Hilfe des N-Terminus in die Doppelmembran. Dies führt zu einer Reorientierung bezüglich der Oberflächennormalen von einem Winkel von 78° - 69° in der horizontal adsobierten Form hin zu 21° im inkorporierten Zustand. Als Teil der Atmungskette koppelt der bakterielle Complex I (CpI) den Elektronentransfer zwischen Nicotinamidadenindinukleotid (NADH) und Ubichinon resultierend in einer Oxidation bzw. Reduktion. Die darauf folgende Protonenübertragung über die Bakterienmembran hat eine wichtige Funktion für die Energiebereitstellung der Bakterienzelle. CpI wurde in ein Lipidmembransystem inkorporiert, das auf einer selbstassemblierten Monolage aus (de)protonierbarem 4-Aminothiophenol (4-ATP), einem POPC:POPA Lipidgemisch und Ubichinon zusammengesetzt ist. Neben seiner Funktion als Linker- Molekül, dient 4-ATP ebenso als pH Sensor, wie ergänzende DFT Rechnungen bestätigten. Somit wurde die Protonentranslokation über die Membran mittels des Protonierungsgrades von 4-ATP in zwei komplementären Ansätzen abhängig von der Proteinorientierung ermittelt. Die induzierte Änderung des Quotienten der Amid I/Amid II Bandenintensität zeigte katalytische Konformationsänderungen, die eine mögliche Bewegung von Transmembranhelices oder anderer Sekundärstrukturelemente einschließen.
