Reconstruction of the lantibiotic ruminococcin-A biosynthesis machinery in Escherichia coli and structural characterization
Ongey, Elvis Legala
Lanthipeptides are a group of therapeutically relevant proteinaceous compounds predominantly produced by Gram-positive bacteria at the ribosomal level, containing thioether cross-linked amino acids called lanthionine as a characteristic structural element. Lanthipeptides are attracting growing interests stemming from their wide range of bioactivities including antimicrobial, antiviral and anticancer. However, purifying them from native sources is challenging due low production yields and cultivation difficulties that accompany the natural producers. Ruminococcin-A (RumA) is an example which is naturally produced by the obligate anaerobe Ruminococcus gnavus E1. Culturing R. gnavus E1 is obviously challenging and would certainly negatively affect the development of a stable high-quality production process, limiting biotechnological development and therapeutic exploitation of RumA. In this study, we amplified parts of the RumA biosynthesis operon from R. gnavus E1, encoding the linear precursor peptide (preRumA) and the lanthionine synthetase (RumM), and coexpressed them in the heterologous bacterial host E. coli.
Our results show that RumM catalyzed the introduction of dehydroamino acids into the core peptide of preRumA and subsequently conjugated the dehydrated residues with cysteine to generate thioether bridges. This was achieved with preRumA expressed as a chimeric fusion protein together with GFP. Results here demonstrate that fusing a larger protein carrier to the N-terminus of the leader peptide does not necessarily obstruct in vivo processivity of the lanthionine-generating enzyme in modifying its substrate. A strong interaction was observed between the chimeric fusion product and RumM, supplying some interesting insights into the catalytic mechanisms of class II lanthionine-generating enzymes. Characterizing the structure of preRumA further revealed the presence of three thioether rings, contradicting previous report which concluded that the formation of a third thioether bridge was not possible. Modified preRumA was activated in vitro by removing the leader peptide using trypsin to yield the active product and biological activity was achieved. A production yield of 6 mg of pure modified preRumA per litre of E. coli culture was attained. Considering the size ratio of the leader-to-core segments of preRumA, this amount would produce a final yield of approximately 1-2 mg of RumA when the leader peptide is removed. This yield exceeds the amount of RumA purified from the native host in the order of 104.
This study supplies a system that may be applied as a useful tool for studying peptide engineering to generate analogues of RumA or completely new peptides with superior anti-infective properties. The current system also provides an alternative strategy to derive mechanistic insights on the complex modification machinery of lanthipeptides.
Lanthipeptide sind eine Gruppe von therapeutisch bedeutsamen proteinogenen Naturstoffen, die hauptsächlich von Gram-positiven Bakterien ribosomal produziert werden. Als kennzeichnendes Strukturelement enthalten sie über Thioether verknüpfte Aminosäuren, sogenannte Lanthionine. Auf Grund ihres breiten Wirkspektrums, welches Bioaktivität sowohl gegen Bakterien, Viren als auch Krebszellen einschließt, rücken Lanthipeptide zunehmend in den Fokus der Forschung. Allerdings ist die Gewinnung von Lanthipeptiden aus deren natürlichen Produzenten äußerst schwierig, da diese nur in geringem Maße produziert werden und die Kultivierung der entsprechenden Bakterien auf Grund ihrer Lebensweise schwierig ist. Ein Beispiel hierfür ist Ruminococin-A (RumA), das vom Bakterium Ruminococcus gnavus E1 produziert wird. Eine Kultivierung von R. gnavus ist auf Grund seiner obligat anaeroben Lebensweise schwierig, wodurch die Entwicklung eines stabilen, hoch effizienten Produktionsprozesses erschwert und die biotechnologische Entwicklung bzw. die therapeutische Erforschung limitiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Teile des RumA Biosyntheseoperons aus R. gnavus E1 amplifiziert und im heterologen Wirtsorganismus Escherichia coli exprimiert. Hierzu zählen die Gene für das lineare „Precoursor“-Peptid (preRumA) sowie die Lanthionine-Synthetase (RumM).
Das Enzym RumM katalysiert die Dehydratisierung einzelner Aminosäuren im Kernpeptide von preRumA und anschließend die Bildung der typischen Thioether Brücken durch Konjugation der dehydratisierten Reste mit einem Cystein. Hierfür wurde ein Fusionsprotein aus preRumA und dem grünfluoreszierenden Protein (GFP) produziert. Die Resultate zeigen, dass die Fusion eines größeren Trägerproteins an den N-Terminus des RumA „Leaderpeptides“ dessen Prozessierung in vivo durch RumM nicht negativ beeinflusst. Die beobachtete starke Interaktion zwischen dem chimären Fusionsprotein und RumM ermöglicht einen interessanten Einblick in den katalytischen Mechanismus der Klasse II Lanthionin-Synthetasen. Im Gegensatz zur früheren Annahme, dass die Bildung eines dritten Thioetherrings nicht möglich ist, konnte durch die Aufklärung der Struktur von preRumA das Vorhandensein von drei Thioetherringen nachgewiesen werden. Die Aktivierung des modifizierten preRumA erfolgte in vitro. Das Leaderpeptid wurde hierfür durch Spaltung mit Trypsin entfernt und so das biologisch aktive Produkt gewonnen. Aus einem Liter E. coli Kultur konnten hierbei bis zu 6 mg modifiziertes preRumA gereinigt werden. Bedenkt man das Größenverhältnis zwischen Kernpeptid und Leaderpeptid entspricht diese Menge einer finalen Ausbeute von ca. 1-2 mg aktivem RumA nachdem das Leaderpeptid entfernt wurde. Dies übersteigt die Menge an RumA, die aus dem natürlichen Produzenten gewonnen werden kann, um das 10.000 fache.
Das im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Expressionssystem stellt ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung von Peptiden dar. Es könnte als Grundlage für die Expression von RumA Analoga oder anderer neuer bioaktiver Peptide mit unter Umständen besseren antiinfektiven Eigenschaften dienen. Darüber hinaus bietet unser System eine alternative Möglichkeit zur Untersuchung der komplexen Modifikationssysteme von Lanthipeptiden.
