Untersuchung der Ursachen von Aromaveränderungen an einem alkoholischen Heilkräuterdestillat während einer Reifeperiode Identifizierung und Genese von Fehlgeruchsstoffen vorgelegt vom staatlich geprüften Lebensmittelchemiker Marc Lucas aus Berlin Von der Fakultät III – Fakultät für Prozesswissenschaften der Technischen Universität Berlin zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Naturwissenschaften - Dr. rer. nat. genehmigte Dissertation Promotionsausschuss: Vorsitzender: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl Berichter: Prof. Dr. rer. nat. L. W. Kroh Berichter: Dr. rer. nat. H. Miething Berichter: Prof. Dr. rer. nat. R. Hänsel Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 19.09.2000 Berlin 2000 D 83 Die vorliegende Arbeit ist im Internet unter www.tu-berlin.de veröffentlicht. Danksagung Danksagung Die vorliegende Arbeit entstand von November 1996 bis September 1999 in den Laboratorien der Abteilung Qualitätssicherung der Firma DivapharmaKnufinke GmbH. Mein besonderer Dank gilt Herrn Dr. Holger Miething, Kontrollleiter der Firma Divapharma-Knufinke GmbH, für die Überlassung des Themas, für Betreuung, stete Unterstützung und Motivation, der Geschäftsführung der Firma Divapharma-Knufinke GmbH, hier besonders Herrn Rainer G. Jahn, für die Ermöglichung und Finanzierung der Arbeit und meinem Doktorvater, Herrn Professor Lothar W. Kroh, für die stete Gesprächsbereitschaft, fachliche wie instrumentelle Hilfe und das in mich gesetzte Vertrauen. Ich danke den Mitarbeitern der Abteilungen Qualitätssicherung und Liquida I der Firma Divapharma-Knufinke GmbH, vor allem Frau Kerstin Gienger, Frau Annette Kettner, Frau Rita Mahn, Herrn Dr. Andreas Meier, Herrn Dr. Holger Miething, Herrn Peter Schamal, Herrn Dr. Ralph Schmitt, Frau Diana Schulz und Frau Britta Wellnitz für ihre Mitarbeit bei den sensorischen Untersuchungen und Herrn Manfred Bausemer, Herrn Joachim Flehmer und Herrn Peter Köhler für die Bereitstellung des Untersuchungsmaterials. Für die stets konstruktive Beratung und Hilfe bei allen EDV-technischen Fragestellungen bin ich Herrn Stephan Anger zu großem Dank verpflichtet. Herrn Bob Hatton (Institut für Lebensmittelchemie, TU Berlin) danke ich für die Hilfe und Unterstützung bei der Durchführung der hochauflösenden massenspektrometrischen Messungen. Herrn Dr. Markus Fuchs (Firma Knauer) danke ich für die Durchführung der Aminosäurenbestimmung in den Ausgangsdrogen. Ich danke meinem Freundeskreis: Jochen Gottfriedsen, Matthias Koch und Sabine Mathews für die mir entgegengebrachte Hilfe und Unterstützung sowie Herrn Jonas Fischer und seinem Team. Ich danke meinen Eltern, meiner Schwester und meinem Schwager für die liebevolle Unterstützung, ihre Toleranz und ihr Verständnis. - II - Zusammenfassung / Abstract Untersuchung der Ursachen von Aromaveränderungen an einem alkoholischen Heilkräuterdestillat während einer Reifeperiode Identifizierung und Genese von Fehlgeruchsstoffen M. Lucas Zusammenfassung: An einem aus offizinalen Öldrogen gewonnenen, wässrig-alkoholischen Heilkräuterdestillat wurden erstmals Ursachen von Aromaveränderungen untersucht. Dabei standen das Auftreten und das Verschwinden eines störenden, unangenehmen Geruchseindrucks während einer Reifeperiode im Zentrum des Interesses. Der Fehleindruck kann auf die Gegenwart der Fehlgeruchsstoffe Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan zurückgeführt werden. Beide Verbindungen kommen direkt nach der Herstellung des Destillats in Konzentrationen von 10 bis 50 µg/l vor. Ihre Geruchsschwelle im Produkt liegt bei 5 µg/l. Das Auftreten beider Verbindungen kann durch thermische Abbauprozesse der im eingesetzen Pflanzenmaterial vorkommenden Aminosäuren L-Cystein und L-Methionin bei der Herstellung des Destillats erklärt werden. Es werden drei Mechanismen der Freisetzung dargestellt: Abbau in Gegenwart einer α-Dicarbonylverbindung (Maillard-Reaktionen), Abbau in Gegenwart einer Base (ß-Eliminierung) und der intramolekulare Abbau über Lacton-Bildung. Es wird gezeigt, dass die Konzentration der beiden Fehlgeruchsstoffe im Destillat während einer Reifeperiode abnimmt. Beide Verbindungen können zudem durch Aktivkohlefiltration, Zusätze metallischen Kupfers und Erhöhung des Wasseranteils nachhaltig aus dem Dampfraum über dem Untersuchungsobjekt entfernt werden. Das produkttypische Aroma wird durch die Verbindungen 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol geprägt. Für eine Zunahme der Konzentration dieser als angenehm empfundenen oder anderer, den Geruch aktiv verbessernder Stoffe während der Reifung konnten keine Hinweise gefunden werden. Es wird beschrieben, wie mit Hilfe der Gaschromatographie-Olfaktometrie (GCO) und der Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) sensorisch relevante Verbindungen aus dem Vielstoffgemisch des Destillats identifiziert und Geruchszuständen zugeordnet werden. Gehaltsunterschiede dieser geruchsaktiven Verbindungen zwischen unterschiedlichen Geruchszuständen des Heilkräuterdestillats werden instrumentellanalytisch ermittelt und dienen der Bestätigung der Geruchsstoffzuordnung. Die Vorzüge der artefaktarmen Headspace-Analyse in Kombination mit GC/MS und GCO für die Untersuchung leichtest flüchtiger Verbindungen werden gegenüber anderen Anreicherungstechniken und der Flüssiginjektion von Aromaextrakten dargestellt und erläutert. Es wird ein Verfahren beschrieben, mit dem sich auf der Basis der Kontaktkatalyse mit metallischem Kupfer die beiden schwefelhaltigen Fehlgeruchssubstanzen während der industriellen Fertigung aus dem Produkt entfernen lassen. - III - Zusammenfassung / Abstract Analysis of odour improving changes to a medical, herbal formulation during a storage period Identification and genesis of unpleasant odour by M. Lucas Abstract: The first ever study of the causes of changes in odour of an aqueous-alcoholic distillate obtained from dried medical ethereal herbal plants was undertaken. The study centered on the appearance and subsequent disappearance of a disturbing and unpleasant odour during a maturing process of the distillate. The odour is linked to the presence of hydrogen sulphide and methanthiol. Both compounds occur immediately after the distillation in concentrations of 10-50 µg/l. It was found that the minimum concentration at which the odour can be detected by humans is 5 µg/l (threshold) of either compound. The occurrence of the compounds can be explained by the thermic decomposition during the distillation process of the amino acids L-cysteine and L-methionine, which were found in the raw plant material. The study mentions three paths of decomposition: decomposition in the presence of an α–dicarbonyl compound, the break down in the presence of a base (ß-elimination) and the intra-molecular break down under formation of a lacton. It can be observed that the concentration of both disturbing and unpleasant odour compounds decreased during the process of maturing. In addition, both compounds could effectively be eliminated out of the headspace of the distillate by using charcoalfilters, metallic copper or higher amounts of water. The typical odour of the examined product is characterised by the compounds 1,8Cineol, Linalool and Eugenol. During the maturing period an increase in the concentration of these or other coumpounds with a pleasant odour was shown not to occur. The study describes the use of gaschromatography-olfactometry (GCO) and aroma extract dilution analysis (AEDA) for the identification of olfactory relevant compounds in the distillate. Changes in concentration of these selected odour compounds between different olfactory states of the distillate is shown by objective, instrumental analytical methods and confirms their contribution to the odour. The advantages of headspace-sampling in the examination of volatile compounds as opposed to other techniques to increase the concentration of these compounds or to the liquid-injection of aroma extracts are described and explained. A procedure is described which removes the sulphur containing compounds with metallic copper. - IV - Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Abkürzungen ....................................................................................................................... IX 1. Einleitung ............................................................................................................ 10 1.1 Geruchsstoffe und Geruchssinn........................................................................... 10 1.2 Geruchsstoffe und Arzneimittel ............................................................................ 12 1.3 Geruchsstoffe als pharmazeutische Qualitätskriterien......................................... 14 2. Problemstellung ................................................................................................. 15 2.1 Beschreibung des Untersuchungsmaterials......................................................... 15 2.2 Beschreibung des olfaktorischen Fehleindrucks.................................................. 15 2.3 Beschreibung der Wahrnehmbarkeit des Fehleindrucks ..................................... 16 2.4 Beeinflussung des Fehleindrucks ........................................................................ 17 2.5 Aufgabenstellung.................................................................................................. 19 3. Theoretischer Teil .............................................................................................. 20 3.1 Geruchswahrnehmung und deren stoffliche Ursachen........................................ 20 3.2 3.2.1 3.2.2 Geruchsverbesserung und deren stoffliche Ursachen ......................................... 23 Physikochemie des Phasenübergangs flüssig - gasförmig.................................. 23 Das Chemische Potential in offenen Systemen ................................................... 25 3.3 Erkenntnisse über die stoffliche Zusammensetzung und sensorische Aspekte der Inhaltsstoffe von P................................................................................................ 26 3.4 3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.3.1 3.4.3.2 3.4.3.3 3.4.3.4 Fehlgeruchsstoffe in Lebensmitteln ..................................................................... 29 Faktoren der Entstehung von Fehlgerüchen........................................................ 30 Aromabildung in alkoholischen Getränken........................................................... 31 Reifungstechniken bei alkoholischen Getränken ................................................. 32 Alterungsverfahren durch Wärmeeinwirkung ....................................................... 32 Alterungsverfahren durch Oxidationsmittel und durch Bewegung ....................... 33 Alterungsverfahren durch Ultraschall ................................................................... 33 Alterungsverfahren durch Einfluss von Chemikalien und Katalysatoren ............. 33 3.5 Zusammenfassung der Kenntnisse über Aromaveränderungen in P .................. 34 3.6 3.6.1 3.6.2 3.6.3 3.6.4 Analytik von Geruchsstoffen................................................................................. 36 Gaschromatographie-Olfaktometrie (GCO) ......................................................... 36 Hinreichende Bedingungen der Identifizierung von Geruchsstoffen mittels GCO38 Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA).......................................................... 40 Hinreichende und notwendige Bedingungen der Identifizierung von problemrelevanten Geruchsstoffen in P............................................................... 41 -V- Inhaltsverzeichnis 4. Experimenteller Teil ........................................................................................... 43 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.2.1 4.1.2.2 4.1.2.3 4.1.2.4 4.1.2.5 4.1.3 Material................................................................................................................. 43 Herstellungsschema des Untersuchungsobjekts P.............................................. 43 Probenvorbereitung: Anreicherungsverfahren ..................................................... 44 Destillative Anreicherungen von P ....................................................................... 44 Extraktive Anreicherungen ................................................................................... 45 Kondensationen in Kühlfallen............................................................................... 45 Festphasen-Mikroextraktion (SPME) ................................................................... 47 Headspace-Analyse (HS)..................................................................................... 48 Verfahren zur Beeinflussung des Fehleindrucks an P ......................................... 48 4.2 4.2.1 4.2.1.1 4.2.1.2 4.2.2 4.2.2.1 4.2.2.2 4.2.2.3 4.2.3 4.2.4 4.2.5 4.2.5.1 4.2.5.2 4.2.5.3 Methoden ............................................................................................................. 50 Sensorische Untersuchungsmethoden ................................................................ 50 Verkostungen ....................................................................................................... 50 Profilanalyse und Rangordnungsprüfung............................................................. 51 Gaschromatographie-Olfaktometrie (GCO) ......................................................... 51 Sniffing-Port.......................................................................................................... 52 Trennsäulen in der GCO ...................................................................................... 54 Anwendung des Sniffing-Ports............................................................................. 54 Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) ......................................................... 56 Geruchsschwellenwertermittlung ......................................................................... 57 Instrumentelle Untersuchungsmethoden ............................................................. 58 Hochauflösende Gaschromatographie/Massenspektrometrie (HRGC/MS) ........ 58 Hochauflösende Gaschromatographie/hochauflösende Massenspektrometrie (HRGC/HRMS)..................................................................................................... 59 Headspace-Gaschromatographie (HS/HRGC) .................................................... 61 5. Ergebnisse .......................................................................................................... 64 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 5.1.8 Makro-olfaktorische Veränderungen des Fehlgeruchs durch äußere Einflüsse.. 64 Veränderungen durch Lagerzeit........................................................................... 64 Veränderungen durch Aktivkohle ......................................................................... 65 Veränderungen durch pH-Wert-Verschiebungen................................................. 65 Veränderungen durch Wasserzusatz................................................................... 68 Einfluss tiefer Lagertemperaturen ........................................................................ 68 Einflüsse von Unterdruck, Gaswäsche, Ultraschall ............................................. 68 Sensorische Untersuchung von Destillationsfraktionen....................................... 69 Zusammenfassung: Definition von makro-olfaktorischen Zuständen .................. 70 5.1 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 5.2.5.1 5.2.5.2 5.2.5.3 5.2.5.4 5.2.5.5 5.2.5.6 Bewertung von Anreicherungsverfahren.............................................................. 72 Destillative Anreicherung ..................................................................................... 72 Extraktive Anreicherung ....................................................................................... 73 Kondensation in Kühlfallen................................................................................... 73 Festphasen-Mikroextraktion (SPME) ................................................................... 75 Headspace/GC -Kopplungen und deren Einfluss auf die Probenaufgabe........... 76 Temperatur und Dampfdruck ............................................................................... 77 Trägergasdruck, Trägergasgeschwindigkeit und Injektionszeit ........................... 78 Einfluss der Probentemperatur in der HS-Analyse .............................................. 79 Einfluss des Probenvolumens in der HS-Analyse................................................ 80 Indirekte HS/GC/MS-Kopplung ............................................................................ 81 Direkte HS/GC-Kopplung ..................................................................................... 82 - VI - Inhaltsverzeichnis 5.3 5.3.1 5.3.1.1 5.3.1.2 5.3.2 Mikro-olfaktorische Merkmale von P .................................................................... 85 Ergebnisse der GCO ............................................................................................ 85 Marker-Substanzen bei der Gaschromatographie-Olfaktometrie ........................ 87 Headspace/GCO .................................................................................................. 87 Ergebnisse der Aromaextraktverdünnungsanalyse ............................................. 88 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 5.4.4 5.4.5 5.4.6 Ergebnisse der instrumentellen Analytik .............................................................. 91 HRGC/MS-Untersuchungen................................................................................. 91 Stoffliche Veränderungen während der Lagerzeit................................................ 96 Stoffliche Veränderungen durch die Filtration über Aktivkohle ............................ 99 Stoffliche Veränderungen durch pH-Wert-Senkung........................................... 100 Stoffliche Veränderungen durch Wasserzusatz ................................................. 101 Stoffliche Veränderungen bei tiefen Temperaturen ........................................... 103 5.5 Instrumentelle Untersuchung der Destillationsübergänge ................................. 107 5.6 5.6.1 5.6.2 5.6.3 5.6.4 Methylmercaptan und Dimethylsulfid ................................................................. 111 Gehaltsbestimmung mittels HS/GC/MS ............................................................. 111 Geruchsschwelle von Methylmercaptan ............................................................ 112 Geruchsschwelle von Dimethylsulfid.................................................................. 113 Zusammenfassung: Methylmercaptan und Dimethylsulfid und ihre Rolle als Fehlgeruchsstoffe............................................................................................... 114 5.7 5.7.1 5.7.2 5.7.3 Schwefelwasserstoff........................................................................................... 116 Zur Analytik von Schwefelwasserstoff................................................................ 117 Identifizierung von Schwefelwasserstoff in P mittels HRMS .............................. 118 Simulation der Freisetzung von schwefelhaltigen Substanzen aus den eingesetzten Drogen im Labor ........................................................................... 120 5.7.4 Stabilität von Schwefelwasserstoff..................................................................... 122 5.7.5 Korrelation sensorischer Daten mit dem Auftreten von Schwefelwasserstoff ... 122 5.7.5.1 Einfluss der Lagerzeit......................................................................................... 122 5.7.5.2 Einfluss der Filtration.......................................................................................... 123 5.7.5.3 Einfluss des pH-Wertes...................................................................................... 123 5.7.5.4 Einfluss von Wasser........................................................................................... 123 5.7.5.5. Einfluss tiefer Lagertemperaturen ...................................................................... 123 5.7.6 Gehaltsbestimmung von Schwefelwasserstoff................................................... 124 5.7.7 Geruchsschwelle von Schwefelwasserstoff ....................................................... 126 5.7.8 Schwefelwasserstoff als Fehlgeruchssubstanz.................................................. 127 6. Herkunft und Genese der Fehlgeruchsstoffe ................................................ 128 6.1 Zur Rolle des Schwefels im Pflanzenreich......................................................... 128 6.2 Nachweis und Bestimmung von L-Cystein und L-Methionin im Drogenmaterial 129 6.3 Bestimmung des Gesamtschwefelgehaltes in den Drogen ............................... 129 6.4 Zur Genese von Methylmercaptan und Schwefelwasserstoff............................ 130 6.3 Thermische Abbaureaktionen von L-Cystein und L-Methionin .......................... 132 7. Verfahren zur Schnellreifung von P ............................................................... 135 - VII - Inhaltsverzeichnis 8. Diskussion ........................................................................................................ 138 8.1 Wertung der Untersuchungsergebnisse und -verfahren .................................... 138 8.2 Herkunft und Genese der Fehlgeruchsstoffe ..................................................... 142 8.3 Abbau der Fehlgeruchssubstanzen ................................................................... 144 9. Zusammenfassung........................................................................................... 145 Anhang I............................................................................................................................ 146 Verkostungsprotokoll A, Trio-Vergleichstest...................................................................... 146 Verkostungsprotokoll B...................................................................................................... 148 Verkostungsprotokoll C...................................................................................................... 149 Anhang II .......................................................................................................................... 150 Massenspektrum von Schwefelwasserstoff ...................................................................... 150 Massenspektrum von Methylmercaptan............................................................................ 150 Massenspektrum von Dimethylsulfid ................................................................................. 151 Massenspektrum von 1,8-Cineol ....................................................................................... 151 Massenspektrum von Linalool ........................................................................................... 152 Massenspektrum von Eugenol .......................................................................................... 152 Literaturverzeichnis......................................................................................................... 153 Lebenslauf........................................................................................................................ 162 - VIII - Abkürzungen Abkürzungen AEVA Aromaextraktverdünnungsanalyse (aroma extract dilution analysis) AMG Arzneimittelgesetz CIC Geruchstyp prägende Verbindung (character impact compound) EI Elektronenstoß (electron impact) EM Emission (emission) EX Anregung (excitation) FID Flammionisationsdetektor (flame-ionisation analyser) FPD Flammphotometrischer Detektor (flame-photometric detector) HRGC Hochauslösende Gaschromatographie (highresolution gaschromatography) HRMS Hochauflösende Massenspektrometrie (highresolution massspectrometrie) HS Dampfraum (Headspace) GCO Gaschromatographie-Olfaktometrie (gaschromatography – olfactometrie) LMBG Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz (vgl. food safty act) MS Massenspektrometrie (mass spectrometrie) PTFE Polytetrafluorethylen (Polytetrafluorethylene) SIM Singel Ionen Monitoring (Single Ion Monitoring) SPME Festphasen-Mikroextraktion (solid phase micro extraction) SSI Split/splitlos Injektor (split/splitless injection) TIC Totalionenstrom (total Ion current) TK Tiefkühlung (deep-freezing) REV Faktor der umgekehrten Übereinstimmung (reverse fit factor) RT Raumtemperatur (room temperature) - IX - Einleitung: Geruchsstoffe und Geruchssinn 1. Einleitung 1.1 Geruchsstoffe und Geruchssinn Der Geruchssinn, der zusammen mit dem Geschmackssinn als „chemischer Sinn“ bezeichnet wird, zählt stammesgeschichtlich wahrscheinlich zu den ältesten der menschlichen Sinne. Obwohl die Wahrnehmung im heutigen alltäglichen, bewussten Leben vor allem von optischen und akustischen Informationen beherrscht wird, bestehen wesentliche Beziehungen zwischen einem wahrgenommenen Geruch und vegetativen sowie emotionalen Reaktionen. Bedeutung von Geruchssinn und Geruchsreizen für den Menschen So können Gerüche zum Beispiel die Sekretion von Speichel und Magensaft beeinflussen. Sie sind aber auch maßgeblich für Empfindungen wie Sympathie und Antipathie verantwortlich. Nicht zuletzt können olfaktorische Reize dem Menschen in einzigartiger Weise Informationen über Identität und Zusammensetzung von Materie vermitteln (KUMPMANN, 1998, S. 267; SCHEPPER und DANIELS, 1997, S. 246), weshalb dem Geruchssinn bis heute eine erhebliche Kontroll- und Schutzfunktion zufällt. Eine Voraussetzung hierfür ist mit der teilweise beeindruckend hohen Selektivität und Sensitivität des menschlichen Geruchssinns gegeben (HATT, 1997, S. 757). Olfaktorische Reize entstehen, wenn flüchtige Verbindungen mit speziellen Strukturen, den sogenannten Rezeptoren, der Sinneszellmembran regia olfactoria im oberen Bereich der menschlichen Nasenmuschel interagieren (TIPPMANN, 1998, S. 59, BUCHBAUER und SELOS, 1997, S. 82; OHLOFF, 1990, S. 3). Abb. 1-1: Querschnitt durch den menschlichen Kopf, Lokalisation der regio olfactoria Der Mensch kann unzählig viele, verschiedene Gerüche wahrnehmen und Schätzungen zufolge etwa 10.000 verschiedene olfaktorische Reize unterscheiden (HATT, 1997, S. 757, OHLOFF, 1990, S. 2). - 10 - Struktur-WirkungBeziehung ist sehr komplex Einleitung: Geruchsstoffe und Geruchssinn Abb. 1-2: Strukturformeln von Duftstoffen mit gleichem Geruch Die Selektivität der Interaktionen zwischen Duftstoffmolekül und Rezeptor und damit die Struktur-Wirkung-Beziehung O kann dabei sehr unterschiedlich sein. So können einerseits ca. 75 Substanzen unterschiedlichster chemischer Struktur, Cyanwasserstoff oder die HC N aromatische Verbindung Benzaldehyd zählen zu den bekanntesten VertreBenzaldehyd Cyanwasserstoff “bittere Mandeln” “bittere Mandeln” tern dieser Gruppe (Abb. 1-2), den Geruchseindruck von „bitteren Mandeln“ erzeugen, andererseits bereits kleinste Änderungen in der MolekülO O struktur eines Duftstoffes zu drastischen Unterschieden im Geruchsempfinden führen. So riechen die Enantiomere des Carvons in der (-)-Form nach Minze, in der (+)-Form nach (-)-Carvon (+)-Carvon Kümmel (vgl. Abb: 1-3; TAURIN, “Minze” “Kümmel” 1996, S. 783; OHLOFF, 1990, S. 41). Ergänzend zum Spektrum der unterschiedlichen Selektivität der Wahrnehmung kommt, dass sich Geruchseindrücke im Allgemeinen aus einer Kombination mehrerer olfaktorischer Reize zusammensetzen. Gerade diese enorme stoffliche Vielfalt und strukturelle Komplexität unserer Geruchswelt mögen Gründe dafür sein, dass über die molekularen Prozesse der Duftwahrnehmung und die oben beschriebenen Variationen der Struktur-Wirkung-Beziehungen bei Duftstoffen auch heute noch relativ wenig Erkenntnisse vorliegen (TAURIN, 1996, S. 773, BUCHBAUER und SELOS, 1997, S. 81, HATT, 1997, S. 757). Duftstoffe sind wesentliche Qualitätsparameter von Verzehrsmitteln Neben dem Interesse der Neurophysiologie an Duftstoffen sind diese seit jeher Gegenstand der lebensmittelchemischen Forschung, zählen sie doch zusammen mit den Geschmacksstoffen zu den wesentlichsten Qualitätsparametern unserer Nahrung (ZERVOS und ALBERT, 1992, S. 676 ff.; NEUMANN und MOLNÁR, 1991; ACREE, 1990, S. 1 ff.). Sie spielen daher in der sensorischen Analytik, in der Qualitätssicherung bei der Produktion von Lebensmitteln, aber auch bei der Feststellung von Verbraucherpräferenzen (hedonischen Untersuchungen) eine zentrale Rolle (FLIEDNER, 1989, S. 10). Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Suche nach Duftstoffen, die einem Verzehrsmittel temporär einen untypischen, unangenehmen Geruchseindruck verleihen. Allerdings wird hier die lebensmittelchemisch vertraute Fragestellung auf eine pflanzliche, arzneiliche Formulierung übertragen, was im Folgenden näher erläutert wird. - 11 - Einleitung: Geruchsstoffe und Arzneimittel 1.2 Geruchsstoffe und Arzneimittel Der Begriff des Arzneimittels ist im Arzneimittelgesetz (AMG) definiert. Das Gesetz, das zum Zwecke der Sicherheit im Verkehr mit Arzneimitteln, insbesondere ihrer Qualität, Wirksamkeit und Unbedenklichkeit erlassen worden ist, beschreibt in § 2 Abs. 1 AMG „Arzneimittel als Stoffe und Zubereitungen aus Stoffen, die dazu bestimmt sind, durch Anwendung am oder im menschlichen Körper Krankheiten, Leiden, Körperschäden oder krankhafte Beschwerden zu heilen, zu lindern, zu verhüten oder zu erkennen“. In § 2 Abs. 3 Nr. 1 AMG grenzt der Gesetzgeber das Arzneimittel vom Lebensmittel ab: „Arzneimittel sind nicht Lebensmittel im Sinne des § 1 des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes“. Definition des Arzneimittels Zentrale Merkmale eines Arzneimittels sind die therapeutische Wirksamkeit und Unbedenklichkeit. Die Aspekte „Ernährung“ und „Genuß“, die nach § 1 des Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetzes Kennzeichen eines Lebensmittels sind, entfallen per definitionem. HÄNSEL (1991, S. 3) weist auch darauf hin, dass bei der heutigen Arzneimittelprüfung die Wirkung chemischer Reize auf Erlebnisqualitäten als bloße Störfaktoren im Allgemeinen bewusst ausgeschaltet werden. Daher müssten Aromaeigenschaften bei der Entwicklung, Produktion und Anwendung von Arzneimitteln eine nebensächliche Rolle spielen und die Berechtigung der Beachtung von Aromakomponenten in einer arzneilichen Formulierung, insbesondere die Fragestellung nach der Natur von unangenehmen Gerüchen, in Zweifel gezogen werden. Dass jedoch Aromakomponenten auch bei Arzneimitteln nicht ohne Grund beachtet werden, wird durch die Untersuchungen von KAEMMERER (1978, S. 77) verdeutlicht. Er stellte die These auf, dass mit der Einnahme von Medikamenten tiefverwurzelte Instinkthandlungen beim Patienten verbunden seien. Dies schloss er aus seinen Beobachtungen, dass Patienten häufig erst einmal, wie das Tier an der Nahrung, am Medikament riechen, bevor sie es zu sich nehmen. Dieses instinktive Verhalten, das in der mehr oder weniger bewusst ablaufenden Geruchskontrolle Ausdruck findet, führt allerdings bei der Einnahme von Arzneimitteln selbst im Falle unangenehmer sensorischer Eindrücke im Allgemeinen nicht zur Verweigerung der Aufnahme. Die Schutzfunktion des Geruchssinns kann beim Verzehr von Medikamenten bewusst unterdrückt werden, da der Patient das Medikament zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung zu sich nehmen will und mit einem Genuss gar nicht rechnet bzw. auf ihn vorsätzlich verzichten kann. Dennoch laufen diese olfaktorischen Kontrollen ab und es ist davon auszugehen, dass die sensorischen Eindrücke gespeichert werden und bei einer wiederholter Applikation des Medikamentes abrufbar sind. Als Folge kann der Patient bei erneuter Anwendung eben diese gewohnten sensorischen Merkmale erwarten. Er prüft die Identität des Arznei- 12 - ...und sie riechen doch ... Einleitung: Geruchsstoffe und Arzneimittel mittels und leitet die gleichbleibende Qualität von den gleichbleibenden, gewohnten sensorischen Eigenschaften ab. Aus diesem Grund sollten arzneiliche Formulierungen, die von Natur aus sensorische Merkmale besitzen und die in Darreichungsformen, die der Patient schmecken oder riechen kann, angeboten werden, gleichbleibende sensorische Merkmale aufweisen. Phytopharmaka enthalten häufig geruchsaktive Stoffe Die Hersteller von Arzneimitteln aus Pflanzen, Pflanzenteilen oder Pflanzeninhaltsstoffen (Phytopharmaka), die in Form von peroral zu applizierenden Mixturen, Elixieren, Tinkturen oder Säften zu den traditionellen Heilmitteln zählen, stehen im besonderen Maße sensorischen Ansprüchen gegenüber. Zum einen, weil ihre Produkte im Gegensatz zu vielen synthetischen Medikamenten definierte sensorische Merkmale besitzen können, zum anderen, weil der Patient, vielleicht sogar aus Kenntnis des Geruchs oder Geschmacks der ursprünglichen Arzneipflanze oder durch vorherige Anwendungen des Produktes bedingt, definierte sensorische Anforderungen stellen kann. Gerade die traditionellen Elemente der Phytotherapie zeigen sich am deutlichsten in der großen Zahl an Arzneidrogen mit Wirkung auf die Sinnesorgane (HÄNSEL, 1991, S. 3). Nicht zuletzt hat der Patient bei pflanzlichen Arzneien, die häufig freiverkäuflich angeboten werden, die Möglichkeit des Produktvergleichs und damit auch die der freien Produktwahl. In einem solchen Fall kann neben der Forderung nach gleichbleibenden sensorischen Eigenschaften, resultierend aus einer gleichbleibenden „inneren“ Qualität, die Gestaltung einer ansprechenden „äußeren“ Qualität des Produktes die Kaufentscheidung beeinflussen. Die äußere Qualität ist Die „äußere“ Qualität umfasst wie bei einem Lebensmittel die Gesamtheit aller auch bei PhytopharmaMerkmale und Eigenschaften, die der Verbraucher/Patient mit seinen Sinnen ka ein wesentliches Merkmal erfassen kann. Merkmale wie Aussehen, Geruch oder Geschmack zählen zu den wesentlichen Qualitätskriterien für Verzehrsprodukte und müssen daher auch für Arzneimittel im Allgemeinen und für peroral zu applizierende Phytopharmaka im Speziellen gelten (vgl. HARNISCHFEGER, 1985, Seite 15). Obwohl es bei Arzneimitteln primär nicht um die Frage geht, ob das Medikament sensorisch positv oder negativ vom Patienten empfunden wird, kann es sich als sinnvoll herausstellen, die Präferenz des Produktes im Rahmen der Rezeptur zu steigern. Hieraus allerdings die Notwendigkeit abzuleiten, die Medikamenteneinnahme zusätzlich an einen Genuss zu koppeln, wäre aus ethischen Gesichtspunkten in den meisten Fällen nicht nur überflüssig, sondern auch verantwortungslos. Der Wahrung einer geschaffenen, sensorischen Identität kommt jedoch heutzutage in Hinblick auf Wettbewerbsituationen verstärkte Bedeutung zu (NEUMANN und MOLNÁR, 1991, S. 14). - 13 - Einleitung: Geruchsstoffe und Arzneimittel 1.3 Geruchsstoffe als pharmazeutische Qualitätskriterien Nach den bisherigen Ausführungen wird es nicht verwundern, dass sensorische Tests bei der Produktentwicklung und der pharmazeutischen Qualitätssicherung von Phytopharmaka eine bedeutende Rolle spielen. Neben der Kontrolle von Fertigarzneimitteln erlangten aber auch Vorschriften zur sensorischen Prüfung von pharmazeutischen Rohstoffen normativen Charakter. So sind zum Beispiel Vorschriften zur Geruchsprüfung im Allgemeinen und zur Geruchs- und Geschmacksprüfung von ätherischen Ölen im Speziellen im Europäischen Arzneibuch (Europäisches Arzneibuch, Kennung 2.8.8) erlassen und damit maßgebend für die Hersteller pharmazeutischer Produkte in Europa. HARNISCHFEGER (1985, S. 15) gibt an, dass sensorische Untersuchungen von arzneilichen Rohstoffen oder Fertigwaren hauptsächlich der Kontrolle einer vorgegebenen Qualität dienen. Zwar müssen die mit den Sinnen erfassbaren Merkmale mit den pharmazeutisch wichtigsten Kriterien [den wirksamkeitsbestimmenden] in Beziehung stehen, dennoch schmälert diese sinnvolle Einschränkung die Bedeutung sensorischer Tests keineswegs. Obwohl objektive chemische, physikalische oder biologische Kennzahlen von pharmazeutischen Rohstoffen oder Fertigarzneimitteln durch leistungsfähige und validierte Prüfmethoden zugänglich geworden sind, werden sensorische Methoden sowohl bei der Produktentwicklung als auch bei der produktionsbegleitenden pharmazeutischen Qualitätssicherung von Phytopharmaka angewendet. Dabei ist vor allem die im Vergleich zu vielen chemischen Untersuchungsprinzipien sehr schnelle Ergebnisfindung von Vorteil. Außerdem können sensorische Tests bei definierten Rezepturen umfassendere Aussagen über die "innere" Zusammensetzung des Produktes oder einer Vorstufe hiervon gestatten, da die kontrollierte "äußere Qualität" im Allgemeinen als Funktion der "inneren Zusammensetzung" aufzufassen ist (vgl. HARNISCHFEGER, 1985). Aus diesem Grund sind sensorische Tests z. B . bei fast allen Stabilitätsprüfungen von Fertigarzneimitteln in den Prüfplänen zu finden. Auch die Problemstellung der vorliegenden Arbeit basiert auf Beobachtungen, die bei solchen Tests im Rahmen der pharmazeutischen Qualitätssicherung aufgefallen waren. - 14 - Bedeutung sensorischer Analysenmethoden Problem- und Aufgabenstellung 2. Problemstellung Um die Aufgabe der vorliegenden Arbeit zu beschreiben, werden zunächst das Untersuchungsobjekt selbst sowie die daran auffällig gewordenen sensorischen Veränderungen dargelegt. Die Darlegung der Beobachtungen zu Beginn der Untersuchungen ist Voraussetzung zur Eingrenzung des Problems und zur Festlegung der Zielrichtung der Arbeit. 2.1 Beschreibung des Untersuchungsmaterials Das Untersuchungsobjekt P Das in der vorliegenden Arbeit zu untersuchende Material, im Folgenden aus Markenschutzgründen mit „P“ bezeichnet, zählt zu der Gruppe der Phytopharmaka und besteht aus einem wässrig-alkoholischen Destillat verschiedenster offizinaler, ätherischer Öldrogen. Der Gehalt an ätherischen Ölen ist mit 650 mg/l spezifiziert, der Alkoholgehalt im Endprodukt beträgt ca. 80 % (v/v). Der Geruch von P Direkt nach der Herstellung von P fiel bei sensorischen Routineuntersuchungen ein produktuntypischer Geruchseindruck auf, der überdies als unangenehm empfunden wurde. Das Auftreten dieses geruchlichen Fehleindrucks war in keinem Fall mit bestimmten Merkmalen des eingesetzten Heilpflanzenmaterials, wie z.B. deren Anbaubedingungen, Ölgehalt oder ihrer Lagerdauer korrelierbar. So traten bei der Gewinnung des reinen, ätherischen Öls aus den gleichen Öldrogen durch Wasserdampfdestillation keine derartigen Geruchseindrücke auf. Die Veränderung Zudem wurde beobachtet, dass der anfängliche, direkt nach der Produktion einmal stärker, einmal schwächer wahrzunehmende Geruchseindruck im alkoholischen Destillat nicht stabil war. Vielmehr veränderte er sich innerhalb weniger Wochen nach Herstellung und ein angenehmes, produkttypisches olfaktorisches Gesamtbild von P entstand. Diese Beobachtung führte sowohl zur Einführung einer mehrwöchigen Reifeperiode, Anwendung verschiedener Verfahren der Kellereitechnik und einer sensorischen Endkontrolle jeder Charge als auch zur Formulierung der Frage nach den Ursachen und Konsequenzen der Veränderungen für die Produktqualität. 2.2 Beschreibung des olfaktorischen Fehleindrucks Trotz einer hohen Erkennungsrate des unangenehmen Geruchseindrucks im Vergleich mit älteren, sensorisch einwandfreien Chargen, fiel es selbst erfahrenen Verkostern schwer, eine verbale Beschreibung des olfaktorischen Eindrucks zu geben. - 15 - Problem- und Aufgabenstellung Das am häufigsten gebrauchte Attribut für den Fehleindruck war "muffig". Aber auch Adjektive wie "brenzlig", "kohlig", "dumpf", "trocken", "leicht fruchtig", "rauchig", "erdig", "kaffeeartig", "süßlich", "kloakig", "schweflig" oder "hart" wurden benutzt, konnten aber den für junge Chargen von P so typisch empfundenen Geruch nur unzureichend charakterisieren. Es ist hervorzuheben, dass die aufgeführten Attribute alle Beschreibungsversuche für ein und dasselbe Phänomen darstellten. Es waren keine assoziativen Vergleiche, die unterschiedliche Geruchzustände klassifizierten, sondern lediglich Beschreibungen, die den tatsächlich empfundenen, untypischen Geruchseindruck eingrenzten. 2.3 Beschreibung der Wahrnehmbarkeit des Fehleindrucks Bei der Wahrnehmung des bei den sensorischen Routineprüfungen auffällig gewordenen, unangenehmen Geruchseindrucks konnten bestimmte Beobachtungen gemacht werden, die zur Eingrenzung des Problems wesentlich waren. So empfanden die Verkoster den Geruchseindruck der ersten Sekunde an einer originären Probe in einem Verkostungsglas (Abbildung S. 50) stets als die sicherste Identifizierungsmöglichkeit des für frisch produzierte Chargen so typischen, unangenehmen Geruchs. Eine Unterscheidung zwischen An- und Hauptgeruch fiel schwer, da der trigeminale Reiz des Alkohols, der in dem originären Destillat etwa 80 % ausmacht, die Geruchswahrnehmung auf wenige Sekunden begrenzte (vgl. MATHEIS, 1995, S. 72-73). Der Fehleindruck schien aber eher der Kopfnote zuordenbar zu sein. Fehleindruck wird der Kopfnote zugeschrieben Überraschenderweise stellte sich heraus, dass die Wahrnehmbarkeit des Fehleindrucks von der Zeitspanne zwischen Füllung der Gläser und Verkostung sowie von der Dauer des geschlossenen Zustandes des Glases zwischen zwei Geruchsprüfungen abhing. Vor allem wenn das Verkostungsglas gerade geöffnet und "abgerochen" worden war, wurde die Wahrnehmbarkeit des Fehleindrucks anschließend als schlechter bis nur noch schwach vorhanden beschrieben. Fehleindruck scheint relativ flüchtig zu sein Eine Adaptation während der Verkostungen konnte als Grund für diese verringerte Wahrnehmbarkeit des Geruchs nicht nachgewiesen werden. So war die Detektion des Fehlgeruchs durchaus auch an mehreren Verkostungsgläsern hintereinander möglich, die in unregelmäßig alternierender, direkter Abfolge unangenehm und einwandfrei riechende Proben gleich lange enthalten hatten. Weiterhin förderte ein Schwenken des verschlossenen Glases, gelegentlich unter Einwirkung der Handwärme auf das Verkostungsgut, die Intensität des olfaktorisch negativen Eindrucks bzw. dessen „Regeneration“ nach dem Ab- 16 - Problem- und Aufgabenstellung riechen. Grundsätzlich schien sich aber auch in einem verschlossenen Verkostungsglas die Geruchsqualität kleiner Volumina (z.B. bei etwa 30 ml) des Untersuchungsmaterials innerhalb nur weniger Stunden zu verbessern. Diese Beobachtungen gaben bereits zu Beginn der Untersuchungen erste Hinweise darauf, dass am Zustandekommen des unangenehmen Geruchseindrucks eine oder mehrere Substanzen (Fehlgeruchsstoffe) beteiligt sein konnten, die zudem in der Untersuchungsmatrix eine relativ hohe Flüchtigkeit aufweisen müssten. 2.4 Beeinflussung des Fehleindrucks Wesentliche, zusätzliche Erkenntnisse, die die zuvor gemachte Annahme über die leichtest flüchtigen Fehlgeruchsstoffe zu bestätigen und eine erste Eingrenzung der Ursachen des anfänglich wahrzunehmenden Geruchseindrucks auf konkret, substantiell vorliegende Substanzen zuzulassen schienen, ergaben sich durch folgende Beobachtungen: Filtration Schon frühzeitig war festgestellt worden, dass Umwälz- und Filtrationstechniken, wie sie bei der Reifung von alkoholischen Getränken nicht ungewöhnlich sind (vgl. WÜSTENFELD und HAESELER, 1964, S. 365ff.), zu einer beschleunigten Verbesserung des Gesamtgeruchs führten. Besonders durch die Filtration von P über Aktivkohle, nicht so sehr durch alleiniges Umwälzen, war eine signifikante, subjektive Verbesserung des Geruchseindrucks zu erzielen. Die olfaktorische Erkennungsrate des derart verbesserten Geruchs eines filtrierten Musters im Vergleich zu seiner unfiltrierten Variante lag in praxi bei 100 % (vgl. Kapitel 5.1.2, S. 65). Lagerzeit Bei einem weiteren Versuch mit drei erfahrenen Verkostern sollten 6 aufeinanderfolgende, im Abstand von nur etwa einer Woche produzierte Chargen aufgrund ihres Geruchs ihrem Alter nach sortiert werden. Obwohl dieser Test nur exemplarisch durchgeführt wurde und wegen der geringen Anzahl von Prüfergebnissen keine statistisch abgesicherte Aussage zuließ, war bemerkenswert, dass etwa zwei Drittel aller Proben richtig, d.h. zwischen die jeweils zuvor und danach produzierte Charge eingeordnet worden waren. Dies war zum einen ein weiterer Hinweis darauf, wie reproduzierbar der beschriebene Fehleindruck in seinem Charakter bei den unterschiedlichen Chargen auftrat, zum anderen führte dies zu der Annahme, dass sich der Geruchseindruck während der Reifeperiode innerhalb weniger Wochen mehr oder weniger stetig verändert. - 17 - Problem- und Aufgabenstellung subjektive Intensität des Fehleindrucks Abbildung 2-1 deutet diesen Sachverhalt graphisch an. Durch die erste FiltraAbb. 2-1: tion erfolgt zunächst die sprung1 Darstellung der prohafte Verbesserung des Geruchs. gnostizierten, stetigen Abnahme des unangeFür den Fall, dass das Niveau des nehmen Geruchseindrucks während der produkttypischen Geruchs zu lang1. Filtration Reifeperiode. sam erreicht worden wäre, hätte 2. Filtration eine zweite Filtration diesen Vorgang wiederum beschleunigen Geruchsniveau von P können. Die Darstellung darf aller0 dings nicht suggerieren, dass mit 0 1 dem Verlauf eine ebenfalls abnehLagerzeit mende Konzentration eines oder mehrerer potentieller Fehlgeruchsstoffe zwangsläufig korreliert sein muss. Würde analog dazu die Verbesserung des Geruchs über der Zeit aufgetragen, müsste der reziproke, positive Wert der Steigung der in der Abbildung angedeuteten stetigen Veränderung gewählt werden (vgl. Kapitel 3.2, S. 23). Die nebenstehende Abbildung 2-2 stellt den Einfluss der zugesetzten Wassermenge auf die subjektive Wahrnehmbarkeit des Fehleindrucks dar. Aus ihr geht hervor, dass bereits ein Zusatz von 1 ml Wasser zu 5 ml Probe (20 % des Probevolumens) eine drastische Reduktion der Fehlgeruchsempfindung zur Folge hat. subjektive Intensität des Fehleindrucks Kurioserweise verschwand das Phänomen zudem schlagartig, wenn P mit Wasser verdünnt wurde. Selbst geringe Mengen Wasser nivellierten alle wahrnehmbaren Geruchsunterschiede und der gewohnt angenehm würzige Geruch des Produktes trat altersunabhängig zutage. Abb 2-2: Abnahme des unangenehmen Geruchseindrucks nach Wasserzusatz 100 0 0 2 4 6 8 10 Wasserzusatz in ml Bei den Routineverkostungen wurde das Probevolumen sogar um etwa 200 % durch Wasserzugabe vergrößert. An solchen auf Trinkstärke mit Wasser verdünnten Mustern des Heilkräuterdestillates konnten damit auch keine signifikanten Geruchsunterschiede mehr wahrgenommen werden. Aber auch geschmackliche Abweichungen oder optische Unterschiede, wie Farbe, Opaleszens oder Trübung konnten an P unterschiedlichen Reifegrades nicht festgestellt werden. Andere Parameter als der Geruch der originären Proben spielten daher bei den Untersuchungen der auffälligen Veränderungen keine Rolle. - 18 - Wasser Erste Eingrenzung des Problems Problem- und Aufgabenstellung Neben der Beobachtung der offenbar hohen Flüchtigkeit (Kapitel 2.3) wies der geschilderte Einfluss der Filtration auf den Geruchseindruck wiederum auf substanziell vorhandene Fehlgeruchsstoffe hin, die überdies einen relativ polaren Charakter besitzen mussten. Gerade die Geruchsveränderung nach Wasserzugabe schien zunächst mit der angenommenen hohen Flüchtigkeit potentieller Fehlgeruchsstoffe im Widerspruch zu stehen. Neben der Unerklärlichkeit der Herkunft, der Schwierigkeit vorab eine Eingrenzung auf bestimmte Substanzen vorzunehmen und der möglichen Instabilität arzneilich wirksamer Komponenten im Produkt führte dieser Widerspruch zur Formulierung der Frage nach den Ursachen des „Phänomens Fehlgeruch“. 2.5 Aufgabenstellung Aufgabe der vorliegenden Arbeit ist, die während der Reifeperiode ablaufenden, olfaktorisch auffälligen Aromaverbesserungen an P auf objektive, stoffliche Vorgänge zurückzuführen. Hierfür müssen verschiedene Geruchszustände von P definiert bzw. gezielt erzeugt werden und umfassend durch olfaktorische und instrumentell-analytische Methoden charakterisiert werden. Die Untersuchungen sollen die geruchsaktiven Komponenten aus dem Vielstoffgemisch P selektieren und die aromaprägenden Verbindungen den jeweiligen Geruchszuständen zuordnen. Die subjektive Zuordnung der sensorischen Merkmale zu einzelnen Geruchszuständen hat dabei Voraussetzungen und Bedingungen der unterschiedlichen Geruchswahrnehmung zu entsprechen, die mit geeigneten, objektiven Verfahren überprüfbar sein müssen. So müssen für die selektierten Geruchsstoffe Gehaltsänderungen zwischen den unterschiedlichen Geruchszuständen objektiv nachweisbar sein, die überdies den Konzentrationsbereich der Geruchs- bzw. Erkennungsschwelle miterfassen. Die Identifizierung der für die aromaverbessernden Prozesse verantwortlichen Substanz(en) soll als Voraussetzung für eine Eingrenzung der Herkunft und Ursachen für das Phänomen dienen. Die Bewertung der Ursachen soll Aussagen über die Stabilität des Produktes erweitern. Zusätzliches Ziel der Arbeit ist, Maßnahmen aufzuzeigen bzw. zu entwickeln, die bei Wahrung der Produktqualität die durch das Auftreten des unangenehmen Geruchseindrucks erhöhten Produktions- und Lagerkosten senken helfen. - 19 - Theoretischer Teil: Stoffliche Ursachen der Geruchswahrnehmung 3. Theoretischer Teil Wie in der Einleitung bereits dargestellt, beschäftigt sich die vorliegende Arbeit mit den stofflichen Ursachen, die zur Ausprägung zweier verschiedener, olfaktorischer Eindrücke am Untersuchungsobjekt P führen. Dabei liegt der Unterschied in der Präferenz des Geruchs: Vor der Lagerung wird er als subjektiv unangenehmer empfunden als nach der Lagerung. Im Folgenden werden die theoretischen Grundlagen und Voraussetzungen, die für die Ausprägung eines Geruchseindrucks verantwortlich sind, beschrieben. Dabei soll es zunächst unerheblich sein, ob es sich um positiv oder negativ empfundene Eindrücke handelt. Erst in Kapitel 3.2 auf S. 23 werden die Überlegungen zur „Geruchswahrnehmung“ um die hedonischen Komponenten zur „Geruchsverbesserung“ erweitert. 3.1 Geruchswahrnehmung und deren stoffliche Ursachen Da P ein Vielstoffgemisch darstellt, können am Zustandekommen jedes der beiden wahrgenommenen Geruchseindrücke theoretisch ein oder mehrere olfaktorische Reize (Geruchsstoffe) beteiligt sein. Im ersten Modellfall wäre der Charakter eines der beiden zu untersuchenden olfaktorischen Zustände von nur einem einzigen Duftstoff dominiert. Solche aromaprägenden, typischen, unverkennbaren Verbindungen werden auch „character impact compounds/components“ (CICs) genannt (ZIEGLER UND ZIEGLER, 1998, S. 353). Bekannte Beispiele für derartige Aromastoffe sind 4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyd (Vanillin, CAS-NR. 121-33-5, Vorkommen: Vanilleschote), 4Allyl-2-methoxyphenol (Eugenol, CAS-NR. 97-53-0, Vorkommen: Nelke), 1-(4Hydroxyphenyl)-3-butanon (Himbeerketon, CAS-NR. 5471-51-2, Vorkommen: Himbeere) oder Octahydro-4,8a-dimethyl-4a(2H)-naphthol (Geosmin, CASNR. 23333-91-7, Vorkommen: Rote Beete). Bei diesen Verbindungen ist es leicht verständlich, dass ihre Bildung bzw. ihr Verschwinden in einer Matrix zwangsläufig zu unterschiedlichen Geruchseindrücken führen muss. Damit aber ein olfaktorischer Reiz durch eine solche CIC oder einen anderen Duftstoff erzeugt werden kann, muss gewährleistet sein, dass die Konzentration der wahrzunehmenden Substanz in der (das Untersuchungsobjekt) umgebenden Luft über der sogenannten Reiz-, Wahrnehmungs- oder Geruchsschwelle für den Menschen liegt. Als Reizschwelle wird diejenige Konzentration einer Substanz definiert, die bei 50 % der Probanden einer Testgruppe gerade noch einen Reiz und damit eine Geruchswahrnehmung auslöst (LAND, 1989, S. 17). Hier wird bereits die Abhängigkeit dieser Grenze und damit der Geruchswahrnehmung von Verteilungsgleichgewichten deutlich (vgl. Kapitel 3.2.1, S. 23). Die Geruchsschwelle von definierten Duftstoffen wird üblicherweise in Luft - 20 - character impact compounds Reizschwelle Theoretischer Teil: Stoffliche Ursachen der Geruchswahrnehmung bestimmt, da Luft die eigentliche Matrix während der Reizerzeugung darstellt. Eine Größe, die die Duftstoffeigenschaften unter anderen Matrixeinflüssen als die der Luft zu beschreiben versucht, ist der Aromawert. Aromawert Der Aromawert einer Substanz ist als Quotient aus der in der Probe vorhandenen Konzentration des Duftstoffes und seiner Geruchsschwelle definiert (BELITZ und GROSCH, 1992, S. 305, MAARSE und VAN DER BERG, 1989, S. 1-15). Obwohl die Größe des Aromawertes üblicherweise schwer zu bestimmen ist (vgl. auch ACREE, 1993, S. 2, PIGGOTT, 1990, S. 266, ABBOTT et al., 1993, S. 1698) und nur eine Kenngröße in Abhängigkeit des zu betrachtenden Untersuchungsmaterials darstellt (ZIEGLER und ZIEGLER, 1998, S. 402ff.; NEUMANN und MOLNÁR, 1991, S. 79), können mit Hilfe des Aromawertes die wirklich geruchsprägenden Substanzen aus der Gruppe der flüchtigen Stoffe selektiert werden. Mit ihm kann die Geruchsintensität und der tatsächliche Anteil des Duftstoffes an der Gesamtkomposition des Aromas abgeschätzt werden. Konzentrationsabhängigkeit der Geruchswahrnehmung Erschwerend kommt in diesem ersten Modellfall bereits hinzu, dass die Qualität der Wahrnehmung eines Aromastoffes eine Funktion der Konzentration sein kann. Der Geruch von Maltol (C6H6O3) z. B. erinO CH3 nert in niedrigsten Konzentrationen an Fleischbrühe, bei steigenden Konzentrationen an Fleisch, in noch größeren Mengen wird er fruchtig nach Erdbeeren riechend OH beschrieben, um letztendlich als malzig empfunden zu O werden (KUMPMANN, 1998, S. 269). Derartige Abhängigkeiten sind auch von den wenigen ParfümgrundstofMaltol fen tierischen Ursprungs wie Moschus, Ambra oder Zibet bekannt, die in konzentrierter Form extrem unangenehm, in hohen Verdünnungen dagegen sehr positiv im Geruch empfunden werden können. Erkennungsschwelle Diesem Tatbestand wird Rechnung getragen, indem zusätzlich zur Reizschwelle eine Erkennungsschwelle definiert wird. Diese soll die Minimalkonzentration eines Stoffes kennzeichnen, an der sein charakteristischer Geruch tatsächlich auch erkannt und beschrieben werden kann. Im Allgemeinen liegt die Erkennungsschwelle über der Geruchsschwelle und fällt nur in Ausnahmefällen mit dieser zusammen (vgl. z. B. TAMURA, 1996, S. 290). Aromen sind meist komplex zusammengesetzt Geruchsprofile Meist werden Geruchseindrücke aber durch mehr als nur eine Aromakomponente bedingt. Die Vielzahl von Nuancen eines Aromas wird stets durch das Vorhandensein mehrer Aromastoffe und deren Zusammenspiel erzeugt (PIGGOTT, 1990, S. 263-264; ZIEGLER und ZIEGLER, 1998, S. 352-353). Dieser zweite Fall ist in der Geruchswelt damit weit öfter anzutreffen. Der Geruchseindruck, der durch das Zusammenspiel nicht eines, sondern mehrerer olfaktorischer Reize bedingt wird, muss präziser als Geruchsmuster oder – - 21 - Theoretischer Teil: Stoffliche Ursachen der Geruchswahrnehmung profil verstanden werden (HATT, 1997, S. 762). So setzt sich der Geruch z.B. von Rosenöl, Kaffee oder Wein aus mehreren hundert verschiedenen, geruchsaktiven Komponenten zusammen. Aus diesen Gruppen können zwar einige wenige Verbindungen aufgrund ihrer hohen Aromawerte als besonders aromaprägend ausgemacht werden, dennoch ist die Anzahl der für ein wahrnehmbares Aroma verantwortlichen Komponenten meist größer als 10 (OHLOFF, 1990, S. 156; BELITZ und GROSCH, 1992, S. 854; TÄUFEL et al., 1993, Bd. 1, S. 127, NEUMANN und MOLNÁR, 1991, S. 79). Weiter erschwerend für das stoffliche Verständnis am Zustandekommen von Geruchsmustern ist neben der Vielzahl der beteiligten Substanzen die Möglichkeit, dass Komponenten in Mehrstoffgemischen interagieren können. Solche physiko-chemischen/chemischen Einflüsse spielen sich vor allem auf der Ebene der eigentlichen Reizerzeugung ab (ZIEGLER und ZIEGLER, 1998, S. 389 ff.). So können Aromakomponenten die Interaktion anderer Substanzen mit den Rezeptoren der Sinneszelle inhibieren und damit unterdrücken (ACREE, 1990, S. 2) bzw. synergistische Effekte zu Variationen in der Wahrnehmung von Gerüchen führen (NEUMANN und MOLNÁR, 1991, S. 79). Interaktionen von Geruchsstoffen können zu unterschiedlichen Geruchswahrnehmungen führen Mögliche Folgen dieser Interaktionen der unterschiedlichen Geruchsstoffe sind, dass entweder die Untersuchung eines bestimmten Geruchsprofils durch gängige Analysentechnik, bei der das Duftstoffgemisch z. B. aufgetrennt, fraktioniert olfaktorisch untersucht wird, nicht erfolgreich sein kann oder dass sich die bei den Untersuchungen als wesentliche Duftstoffe gezeigten Verbindungen nachträglich nicht in vollem Umfang zu dem erhofften sensorischen Gesamtbild zusammenfügen lassen. Zudem muss bei der Analyse von Geruchsprofilen berücksichtigt werden, dass Geruchsveränderungen auch durch die Abwesenheit bzw. Konzentrationsabnahme eines oder mehrerer Aromastoffe verursacht werden können. Grundsätzlich muss der Kreis der Ursachen der Wahrnehmung von definierten Geruchsmustern im Gegensatz zur Wahrnehmung einzelner Gerüche um die Beachtung fehlender olfaktorischer Reize sowie möglicher Interaktionen bei der Wahrnehmung selbst erweitert werden. Grenzen der fraktionellen Geruchsstoffanalytik von Geruchsprofilen - 22 - Theoretischer Teil: Geruchsverbesserungen 3.2 Geruchsverbesserung und deren stoffliche Ursachen Das zu untersuchende olfaktorische Phänomen zeichnete sich dadurch aus, dass es sich nach Zugabe von Wasser zu P in seiner Wahrnehmung änderte und als angenehmer empfunden wurde. Analog zu den geruchsverbessernden Vorgängen, die während der Reifeperiode ablaufen, können hierfür zwei Prozesse grundsätzlich voneinander unterschieden werden: Abb. 3-1: Stoffliche Veränderungen bei Geruchsverbesserungen Die geruchlichen Verbesserungen basieren auf: 1. der Gehaltsabnahme von einem oder mehreren Fehlgeruchsstoff(en) in der Gasphase über P und/oder 2. der Gehaltszunahme von einem oder mehreren Geruchsstoff(en) in der Gasphase über P mit angenehmen Geruchseindrücken. Die Veränderung der Zusammensetzung der Gasphase über P kann nur durch Veränderungen des Verteilungsgleichgewichtes zwischen flüssiger und gasförmiger Phase bzw. durch Veränderungen der stofflichen Zusammensetzung der flüssigen Phase hervorgerufen werden. Da das Verständnis der Beeinflussung der Zusammensetzung der Gasphase über P von zentraler Bedeutung für das Verständnis von Geruchseindrücken ist, werden die theoretischen physiko-chemischen Grundlagen im Folgenden kurz vorgestellt. 3.2.1 Physikochemie des Phasenübergangs flüssig - gasförmig Über einer idealen Lösung aus zwei Komponenten A und B gibt das RAOULTsche Gesetz den Zusammenhang zwischen den Partial-Dampfdrükken pA und pB und der Zusammensetzung der Lösung wieder: * pA = x A pA bzw. * pB = x B pB . (Gl.1) „x“ ist dabei der Molenbruch der Substanz in der flüssigen Phase und p* der Dampfdruck der reinen Substanz A bzw. B. - 23 - Theoretischer Teil: Zum Phasenübergang flüssig - gasförmig Der Gesamtdampfdruck p der Mischung setzt sich nach dem DALTONschen Gesetz additiv aus den einzelnen Partialdrücken zusammen, so dass gilt: * * * * * p = pA + pB = x A pA + xB pB = pB + ( pA − pB )x A (Gl. 2) Aus der Gleichung ist ersichtlich, dass der Gesamtdampfdruck bei konstanter Temperatur linear von der Zusammensetzung abhängt. Würde die Konzentration einer Substanz in der flüssigen Phase steigen, würde sich ohne Berücksichtigung der veränderten Matrixeinflüsse auch ihre Konzentration in der Gasphase erhöhen. Analoges gilt für abnehmende Konzentrationen. Stehen flüssige und gasförmige Phase im Gleichgewicht, so muss ihre Zusammensetzung aber nicht notwendigerweise übereinstimmen. Es ist vielmehr zu erwarten, dass die Komponente mit der höheren Flüchtigkeit sich im Dampfraum relativ zur Komponente mit der geringeren Flüchtigkeit anreichert. Nach dem DALTONschen Gesetz lassen sich die Molenbrüche y für die Komponenten A und B in der Gasphase wie folgt definieren: yA = pA p bzw. yB = pB p (Gl. 3) Setzt man Gleichung 1 und 2 in Gleichung 3, lässt sich der Molenbruch der Komponente A bzw. B unter Berücksichtigung ihrer Dampfdrücke in Abhängigkeit der Zusammensetzung der flüssigen Phase ableiten: yA = * x A pA * * * pB + ( pA − pB )x A bzw. yB = 1− y A (Gl. 4) Wenn A die flüchtigere Komponente und damit ihr Dampfdruck p*A>p*B ist, ist der Molenbruch yA in der Gasphase größer als der Molenbruch xA in der flüssigen Phase. Dieser Sachverhalt wird durch die nebenstehende Graphik (Abb. 3-2) verdeutlich. Abb. 3-2: Verschiebungen der Zusammensetzung flüssige gasförmige Phase in Abhängigkeit des Dampfdrucks Je flüchtiger A ist, umso mehr verschiebt sich das Gleichgewicht zu größeren Molenbrüchen yA in der Gasphase. Der hier dargestellte Zusammenhang stellt anschaulich u.a. die Grundlage der destillativen Stofftrennung dar. Duftstoffe, die sich aufgrund ihrer Flüchtigkeit im Dampfraum eines Untersuchungsmus- - 24 - Theoretischer Teil: Zum Phasenübergang flüssig - gasförmig ters anreichern, können somit das Aroma wesentlich beeinflussen, obwohl sie in der Matrix unter Umständen nur in Spuren nachzuweisen sind. Abschließend bleibt die Frage zu klären, wie sich die Änderung des Dampfdrucks einer Substanz in einem Mehrkomponentensystem in Abhängigkeit der Zusammensetzung, also z.B. bei Wasser- oder Säurezusatz, verständlich machen lässt. 3.2.2 Das Chemische Potential in offenen Systemen Eine wesentliche Größe zur Charakterisierung des Dampfdruckes einer Substanz ist ihre Verdampfungsenthalpie ∆Hverd. Nach der TROUTONschen Regel ist die molare Verdampfungsenthalpie näherungsweise proportional dem Siedepunkt Ts der Substanz. ∆HVerd ,m Ts ≈ konstant (Gl. 5) Eine Substanz A mit einer niedrigen Siedetemperatur besitzt demnach eine niedrigere Verdampfungsenthalpie als eine Substanz B mit einer höheren Siedetemperatur. Die Verdampfungsenthalpie H ist eine extensive physiko-chemische Größe und als solche wie die GIBBsche Freie Enthalpie G von der Zusammensetzung des betrachteten Systems abhängig. Extensive Größen sind im Gegensatz zu intensiven Größen vom Umfang der Probe (System) abhängig. G ist damit nicht nur eine Funktion von p und T, sondern auch von den Komponenten ni. In offenen Systemen erhält man für allgemeine Änderungen dG:  ∂G   ∂G   ∂G   ∂G  dG =   dp +   dT +   dn1 + ....+   dnj (GL. 6)  ∂p   ∂nj   ∂n   ∂T p,n1,n2,...  T ,n1,n2,...  p,T,ni,...  1 p,T,n2,... Der Anteil einer Komponente i eines Systems an solchen extensiven Größen wird auch als chemisches Potential µi definiert:  ∂G  µi =   ∂n    i  p,T ,n j ... (Gl. 7) Setzt man Gleichung 7 in Gleichung 6 ein, so erhält man bei konstantem Druck p und Temperatur T: dG = µ1dn1 + µ 2dn2 + µ 3dn3 + .... - 25 - (Gl. 8) Theoretischer Teil: Zum Phasenübergang flüssig - gasförmig Da die GIBBsche Freie Enthalpie G eine Funktion von H ist, kann analog definiert werden:  ∂H  µi =   ∂n    i  p,S,n j,... (Gl. 9) Diese Überlegungen zeigen, dass sich Zustandsgrößen wie G oder H in offenen Systemen bei der Änderung der Zusammensetzung zwangsläufig ändern müssen. Da die chemischen Potentiale µ zwischen zwei sich im Gleichgewicht befindenden Systemen gleich sind, muss eine Änderung der Zusammensetzung in einem System zu einer Änderung des chemischen Potentials und damit zu einem Ungleichgewicht führen. Veränderungen der Zusammensetzung der flüssigen Phase führen zwangsläufig auch zu Veränderungen in der Gasphase Von welcher Qualität die Änderungen sind, lässt sich dagegen theoretisch nur schwer vorhersagen, da das chemische Potential sowohl von der Substanz als auch von dem System abhängig ist. Besonders deutlich wird diese Abhängigkeit bei nicht idealen, realen Systemen. So kann der Zusatz ionischer Verbindungen zu Wasser zu einer Siedepunktserhöhung des Wassers führen (Dampfdruck des Wassers wird herabgesetzt). Die Löslichkeit von nicht ionogenen Gasen nimmt aber aufgrund von Störungen der Hydratisierung gleichzeitig ab und der Dampfdruck dieser Verbindungen steigt (vgl. Aussalzeffekt, ATKINS, 1990, S. 216). Der Dampfdruck über der Mischung zweier chemisch unterschiedlicher Verbindungen kann sowohl größer als die Summen der einzelnen Partialdrücke sein (z.B. in einem Gemisch aus Aceton und Schwefelkohlenstoff) als auch kleiner (Prinzip der Wasserdampfdestillation). Die eigentliche Qualität der Verschiebung des Gleichgewichts ist also im hohen Maße von der chemischen Natur der an der Änderung der Zusammensetzung beteiligten Substanzen abhängig. Um die beobachteten Geruchsverbesserungen bei P bei Wasserzusatz und vielleicht auch die durch die Lagerzeit bedingten zu verstehen, sind weiterreichende Erkenntnisse über die Zusammensetzung von P notwendig. Vorhersagen und Einschränkungen des vorliegenden Problem auf bestimmte Stoffklassen sind aus diesen theoretischen Überlegungen noch nicht abzuleiten. 3.3 Erkenntnisse über die stoffliche Zusammensetzung und sensorische Aspekte der Inhaltsstoffe von P P stellt ein wässrig-alkoholisches Destillat aus einer Reihe verschiedener ätherischer Öldrogen dar. Aufgrund des Herstellungsverfahrens von P werden aus den eingesetzten Drogen vor allem die ätherischen Öle gewonnen. - 26 - Ätherische Öle Theoretischer Teil: Zur stofflichen Zusammensetzung von P In der Medizin und der Pharmazie zählen zu den ätherischen Ölen flüchtige, stark riechende Stoffgemische von meist flüssiger, ölartiger, selten fester Konsistenz. Sie sind in unpolaren Lösemitteln wie Alkanen, chlorierten Kohlenwasserstoffen oder Alkoholen gut, in Wasser nur schlecht löslich (STEINEGGER und HÄNSEL, 1992, S. 262). Die hohe Flüchtigkeit der „ätherischen“ Öle stellt sich im Gegensatz zu den „fetten“ Ölen dadurch dar, dass sie innerhalb von 24 Stunden nach Auftragen auf ein Filterpapier, ohne einen durchscheinenden oder fettartigen Fleck zu hinterlassen, verdunsten (Anforderung Europäisches Arzneibuch 1997, Prüfmethode 2.8.7). Aus chemischer Sicht sind ätherische Öle Gemische aus leichtflüchtigen Kohlenwasserstoffen, Alkoholen, Aldehyden, Ketonen, Estern, Lactonen, Schwefel- und/oder Stickstoffverbindungen. 1995 umfasste die Gruppe etwa 8000 Verbindungen. (RÖMPP LEXIKON CHEMIE, 1995, S. 1248, TÄUFEL, 1993, S. 135). Die natürlichen ätherischen Öle sind überwiegend Substanzgemische mit einer relativ kleinen Zahl von verschiedenen Majorkomponenten und bestehen häufig nur aus 5 bis 20, seltener aus 50 Einzelsubstanzen (RÖMPP LEXIKON LEBENSMITTELCHEMIE, 1995, S. 257; STEINEGGER und HÄNSEL, 1992, S. 262). Die Untersuchung der Zusammensetzung und die Charakterisierung des ätherischen Öls von Arzneipflanzen beschränkt sich daher zumeist auf diese Majorkomponenten. (vgl. z.B. Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, 1995, WICHTL, Teedrogen, 1989) Sensorische Aspekte offizinaler, ätherischer Öle sind selten Gegenstand ihrer Charakterisierung Sensorische Aspekte ätherischer Öldrogen basieren meist auf der Charakterisierung unpolarer Extrakte Sensorische Aspekte zur Charakterisierung der ätherischen Öldrogen bzw. der aus ihnen ableitbaren arzneilichen Formulierungen sind in der Fachliteratur nur dann zu erwarten, wenn sie charakteristisch für die Qualität, arteigen, typisch und damit im Allgemeinen positiv bewertet werden. Die Untersuchungen folgen aber üblicherweise nicht aromachemischen Aspekten. Bei der Erforschung von offizinalen Öldrogen steht meist die Zusammensetzung der ätherischen Öle im Zentrum des Interesses, gelegentlich mit der Maßgabe der Korrelation therapeutischer Wirksamkeit bzw. der Stabilitätsuntersuchung. Bei diesen Stabilitätsuntersuchungen werden jedoch meistens qualitätsabbauende Prozesse verfolgt, die im Allgemeinen wenn überhaupt mit sensorischen Qualitätseinbußen einhergehen. Im vorliegenden Fall sind aber qualitätsverbessernde Veränderungen aufzuklären. Selbst die chemische Charakterisierung von Heilkräutern, die den Gewürzpflanzen zuordenbar sind, erfolgt üblicherweise unter der Fragestellung der Identifizierung der, das typische, bevorzugte Aroma, prägenden Verbindungen bzw. ausschließlich der Aufklärung der stofflichen Zusammensetzung ohne Berücksichtigung sensorischer Relevanzen. Hinzu kommt, dass bei der Charakterisierung der Inhaltsstoffe ätherischer Öle bzw. der Öldrogen meist Extrakte mit unpolaren Lösemitteln gewonnen werden. Auch bei destillativen Anreicherungsverfahren (nach dem Europäischen Arzneibuch oder mit der KARLSRUHER APPARATUR) werden unpolare Lö- 27 - Theoretischer Teil: Zur stofflichen Zusammensetzung von P semittel wie Xylol oder n-Pentan angewendet (DORNER, 1988, S. 93-106). Selbst wenn die Aufklärung sensorischer Aspekte bei den Untersuchungen pharmazeutisch relevanter Heilkräuter und ihrer ätherischen Öle von Interesse wäre, wäre dieser Tatbestand dafür verantwortlich, dass die im vorliegenden Fall zur Frage stehenden Geruchsstoffe möglicherweise nicht miterfasst würden (vgl. Beschreibung des Einfluss des Wassers, S. 17 ff.). Andere, für die Aromastoffchemie interessante Angaben, über mögliche Vorstufen von Aromastoffen wie z.B. den Proteingehalt oder die Zusammensetzung der Kohlenhydratfraktion der entsprechenden Pflanzenteile oder allgemein über sensorische Eigenschaften einzelner Inhaltsstoffe der eingesetzten Drogen, sind so gut wie nicht veröffentlicht. Nur bei bekanntermaßen auch küchentechnisch verwendeten Kräutern und Gewürzen lassen sich vereinzelt Anhaltspunkte für das Zustandekommen des Aromas finden (STEINEGGER und HÄNSEL, 1988, Seite 313; FARRELL, 1985, Part II). Angaben zu aromarelevanten Pflanzeninhaltsstoffen bei Heilpflanzen sind kaum vorhanden Das Auftreten artfremder, unerwünschter Gerüche bei pflanzlichen Arzneizubereitungen ist zwar bekannt, ihre Herkunft oder ihr Ursprung aber so gut wie nicht erforscht (STEINEGGER und HÄNSEL , 1992, S. 259). Aus Sicht der Medizin ist die phytotherapeutische Heilmittelgruppe inhomogen, die Wirkung von Arzneipflanzen oder deren offizinalen Zubereitungen bekanntermaßen selten einer definierten Substanz bzw. –gruppe zuzuschreiben. So kann die Gesamtheit der Inhaltsstoffe einer Heilpflanze, die die Gruppe der sekundären Pflanzeninhaltsstoffe mit einschließt, Wirkungen zeigen, die mit Wirkstoffpräparaten definierter chemischer Konstitution nicht zu erzielen sind (HÄNSEL, 1991, S. 6; SCHADEWALDT, 1977, S. 15; VON KRUEDENER, 1993, S. 14). Analog zur Vielfalt der oft nur unzureichend verstandenen medizinisch-physiologischen Wirkungen von Phytopharmaka können die Ursachen der hier zu untersuchenden olfaktorisch-physiologischen Wirkungen unterschiedlichster chemischer Natur sein. Eine problembezogene Eingrenzung der Inhaltsstoffe von P aufgrund der bekannten Literaturdaten der Zusammensetzung ist damit nicht möglich. Phytopharmaka sind komplexe Systeme So kann vorab nur ein unzureichender Überblick über die theoretischen Inhaltsstoffe von P und deren olfaktorische Relevanz gewonnen werden. Zwar kann die Gegenwart geruchsaktiver Substanzen innerhalb der Gruppe der ätherischen Öle als gesichert gelten, über die genaue chemische Zusammensetzung des Untersuchungsmaterials liegen aber nur wenige Daten vor. Die einzige Veröffentlichung über die Inhaltstoffe von P stammt von WAGNER und SPRINKMEYER (1973, S. 749). Sie haben 1973 mittels DC, Kapillar-GC, Infrarot- und Massenspektroskopie ca. 100 einzelne Terpenverbindungen nachgewiesen und 16 von ihnen identifiziert: Stand der Erkenntnisse zu Inhaltsstoffen von P - 28 - Theoretischer Teil: Fehlgeruchsstoffe in Lebensmitteln Terpenoide Verbindungen in P α-Pinen Limonen Linalool Eugenol β-Pinen Caryophyllen Terpinen-4-ol Eugenolacetat Camphen Zingiberen α-Terpineol Zimtaldehyd Myrcen p-Cymol Cineol Citral Für das zu untersuchende Phytopharmakon sind bisher keine instrumentellanalytischen / sensorischen Daten erhoben bzw. veröffentlicht worden, die zur Klärung des temporären Auftretens des beschriebenen olfaktorischen Fehleindrucks hätten beitragen können. Die in der Arbeit zu untersuchenden „Vorstufen“ der konfektionierten Fertigware von P, die alleine das olfaktorisch abweichende Merkmal tragen, waren bisher nicht Gegenstand chemisch-analytischer bzw. sensorischer Untersuchungen. 3.4 Fehlgeruchsstoffe in Lebensmitteln Das Auftreten artfremder Gerüche bei Lebensmitteln ist nichts Ungewöhnliches und die Ursachen hierfür sind so vielfältig wie die daran beteiligten Verbindungen. Obwohl nicht sicher ist, dass das bei P zu untersuchende, unangenehme Geruchsphänomen durch substanzielle Fehlgeruchsstoffe verursacht wird, könnte die Betrachtung von ähnlichen Fehlgerüchen bei Lebensmitteln helfen, mögliche Ursachen bzw. vergleichbar ablaufende Entwicklungsprozesse aufzuzeigen. Verantwortlich für das Auftreten von Fehlgerüchen können bei der Erzeugung pflanzlicher Lebensmittel Umweltverschmutzungen und Pestizideinsatz (BEMELMANS und TEN NOEVER DE BRAUW, 1975, S. 85), bei der Lagerung mikrobieller Verderb oder Reaktionen von Inhaltsstoffen (Oxidation, nichtenzymatische Bräunung), der Übergang von Aromastoffen aus oder in Packstoffe oder bei der Lebensmittelverarbeitung thermische Behandlungen oder Fermentationsreaktionen sein (MOLNÁR und NEUMANN, 1991, S. 77). Fehlgerüche bei Lebensmitteln sind häufig substanziell bedingt BELITZ und GROSCH (1992, S. 304) weisen darauf hin, dass viele Fehlgerüche auf substanzielle „character impact compounds" zurückgeführt werden können, da ihr "fälschliches" Auftreten in Konzentrationen über der Geruchsschwelle zwangsläufig zu artfremden Gerüchen führen muss. Beispiele für derartige Verbindungen sind Schwefelwasserstoff (typischer Geruch nach faulen Eiern, Eiweißabbauprodukt, Verderbnisanzeiger von proteinreichen Lebensmitteln), Geosmin (erdiger Geruch, im Erdreich ubiquitär vorkommender Metabolit von Streptomyces-Arten, Kontaminante von vielen Rhizomen), 2Methylisoborneol (muffig, erdig, mikrobieller Metabolit) oder 3-Methylindol (faekalischer Geruch, Eiweißabbauprodukt, Verwesungsindikator). Neben diesen CICs, die auch in alkoholischen Getränken wie Bier oder Wein als Ursa- 29 - Theoretischer Teil: Fehlgeruchsstoffe in Lebensmitteln che für Fehlgerüche nachgewiesen worden sind (vgl. CANTAGREL und VIDAL, 1989, S. 141; NYKÄNEN und SUOMALAINEN, 1983, S. 236 ff.; LEMPERLE, 1981, S. 129), können, dem Charakter des Fehleindrucks an P nahekommend, auch der muffig-schimmelige Geruch von vermutlich mikrobiell erzeugten Alkyl- und Methoxypyrazinen bei weißem und schwarzem Pfeffer (JAGELLA und GROSCH, 1998, S. 101; MAGA, 1987, 269-284) oder die Ausprägung von rauchig-harten Aromen durch Monoterpene wie Phellandrene, Limonen, Sabinen und Pinene (WITTKOWSKI, 1987, S. 110) angeführt werden. Nach BELITZ und GROSCH (1992, S. 307) kann ein olfaktorischer Fehleindruck an Lebensmitteln 1.) durch geruchsaktive Substanzen, die in dem Verzehrsprodukt für gewöhnlich nicht vorkommen und somit einen artfremden Geruch vermitteln (Fehlgeruchsstoffe, engl. Off-Flavour), 2.) durch den Verlust bzw. die verzögerte Bildung von charakteristischen, produkteigenen Aromakomponenten oder 3.) durch Veränderungen im Konzentrationsverhältnis einzelner Aromastoffe bedingt sein. Wie bereits in den Kapiteln 3.1 und 3.2 (S. 20 bzw. 23) dargestellt, muss damit davon ausgegangen werden, dass die geruchlichen Verbesserungen an P durch eine Abnahme der Konzentration an Fehlgeruchsstoffen, durch die Bildung von positiv empfundenen Aromakomponenten bzw. durch eine Kombination aus beiden Prozessen bedingt sein können. Sowohl die ersten Beobachtungen der Beinflussung des Fehleindrucks an P (vgl. Kapitel 2.3, S. 16 und 2.4, S. 17) als auch die Betrachtung der Fehlgeruchsbildung im Lebensmittelbereich lassen substanzielle Ursachen des Phänomen wahrscheinlich erscheinen. Da der zu untersuchende Geruchseindruck aber nur vage mit den typischen Gerüchen oben beschriebener Off-Flavour-Substanzen assoziiert werden kann und in der Literatur - wie bereits dargelegt - keine konkreten Angaben zum vorliegenden sensorischen Problem zu finden sind, sind Aussagen über potentiellen Fehlgeruchsstoffe bzw. Spekulationen über mögliche Ursachen weder angezeigt noch möglich. 3.4.1 Faktoren der Entstehung von Fehlgerüchen Analog zu pflanzlichen Lebensmitteln können für das vorliegende Produkt P eine Vielzahl von äußeren Faktoren und Prozessen benannt werden, die die Entstehung von möglichen Fehlgeruchssubstanzen beeinflussen können. Als potentielle Quellen von Fehlgeruchsstoffen in phytotherapeutischen Arzneizubereitungen müssen zunächst alle natürlich in den eingesetzten Pflanzen vorkommenden Verbindungen angesehen werden, die flüchtig sind oder Vorstufen flüchtiger Verbindungen darstellen und die durch das Herstellungsverfahren in das Arzneimittel gelangen können. Diese Grundzusammensetzung kann nun beeinflusst bzw. verändert werden während - 30 - Theoretischer Teil: Aromabildung in alkoholischen Getränken 1. 2. der Ernte und Einlagerung durch die Wahl des Erntezeitpunktes, durch chemische oder mikrobiologische Prozesse, Trocknungsbedingungen, oder den Zerkleinerungsgrad, 3. der Lagerung der getrockneten Drogen durch Lagerdauer, Temperatur, Luftfeuchte, Licht oder Packmittel, 4. der Destillation durch thermisch bedingte chemische Reaktionen, physikalische Prozesse, Einflüsse von Drogenkomponenten auf das Feisetzungsverhalten anderer Pflanzeninhaltsstoffe oder 5. Untersuchung der Aromaveränderungen sind auf den Herstellungsprozess und die Lagerung zu konzentrieren des Wachstums der Arzneipflanze durch besondere Boden- oder klimatische Verhältnisse, Umwelteinflüsse, Einsatz von Düngemitteln oder Pflanzenschutzmitteln, der Produktlagerzeit durch physikalische oder chemische Prozesse, Umwälzungen, Filtrationen. Da bei der Überprüfung der Qualität der eingesetzten Drogen keine sensorische Anzeichen auftraten, die mit dem Fehlgeruch von P hätten in Einklang gebracht werden können und da das durch Wasserdampfdestillation gewonnene, ätherische Gesamtöl aus den Drogen den Fehlgeruch nicht trägt (vgl. Kapitel 2.1, S. 15), können die interessierenden Aromaveränderungen nur durch Vorgänge während der Destillation (Punkt 4) bzw. während der Reifezeit (Punkt 5) bedingt sein. Gerade Punkt 5 erlaubt es, zu Lebensmitteln, die ihr Aroma erst während einer Reifung entfalten, Parallelen zu ziehen. Erkenntnisse über Reifungsprozesse alkoholischer Getränke werden daher im Folgenden betrachtet. 3.4.2 Aromabildung in alkoholischen Getränken Die Aromastoffchemie während der Herstellung, des Ausbaus und der Reifung alkoholischer Getränke wie Bier, Wein oder Spirituosen ist Gegenstand zahlreicher Publikationen. Auch über Fehlaromen in diesen Getränken ist publiziert worden (z.B. RAPP et al. 1992, S. 485ff.; HOFFMANN et al., 1998; LINSKENSEN und JACKSON, 1988; NYKÄNEN, 1986, S. 84–96; NYKÄNEN und SUOMALINEN, 1983; LEMPERLE, 1981, S. 129-132). Dabei wird allerdings ein Großteil der aroma- und fehlaromabildenden Prozesse auf fermentative Reaktionen zurückgeführt (SUOMALAINEN und LETHONEN, 1980, S. 49). Fermentative Prozesse sind aber bei P aufgrund des Herstellungsverfahrens und des sehr hohen Ethanolgehalts von über 70 % nachweislich auszuschließen. Ebenso findet kein Aromaausbau z.B. durch Fasslagerung statt. Chemische Veränderungen, die wie Oxidations- und/oder Veresterungsreaktionen bekanntermaßen an der Bukettbildung von Wein während der Reifung eine - 31 - Theoretischer Teil: Aromabildung in alkoholischen Getränken Rolle spielen, sind dagegen bei P durchaus denkbar, ihre Aromarelevanz muss aber erst noch untersucht werden. Eine weitere Hürde beim Vergleich von P mit alkoholischen Getränken stellt die Tatsache dar, dass der Fehleindruck bei der Verdünnung von P auf in der Getränkeindustrie gängige Alkoholkonzentrationen von im Allgemeinen unter 50 Vol% gar nicht auffällig ist. Da das Wasserdampfdestillat aus den eingesetzten Drogen keinen Fehlgeruch trägt, können auch Erkenntnisse über Fehlgeruchsstoffe in Spirituosen, die mit Gewürzessenzen aromatisiert sind, nur mit Vorbehalt auf die vorliegende Arbeit übertragen werden. Daher sind Erkenntnisse der Aromabildung in alkoholischen Getränken auf die vorliegende Situation nur eingeschränkt übertragbar, da beim zu untersuchenden Phytopharmakon viele Grundvoraussetzungen (wie Art und Einsatz der Rohstoffe, Herstellungsverfahren, resultierende Alkoholkonzentration, Lagerungsbedingungen) fehlen, die die Aromabildung in den erwähnten Lebensmitteln beeinflussen. Obgleich eine stoffliche Korrelation bzw. Übertragung der Kenntnisse aus der Getränkeherstellung aufgrund der geringen Vergleichbarkeit nicht angezeigt ist, bleibt doch die generelle Übereinstimmung mit dem vorliegenden Problem, dass es sich bei den zu alkoholischen Getränken publizierten aromarelevanten Sachverhalten meist auch um geruchsverbessernde Prozesse handelt. Aus diesem Grunde werden Erkenntnisse über önologische Verfahren der Brau- und Getränkeindustrie, die mögliche Einflussnahmen auf das vorliegende Problem aufzeigen, mit herangezogen. 3.4.3 Reifungstechniken bei alkoholischen Getränken Der Wunsch, die Reifung alkoholischer Getränke zu beschleunigen, hatte vielfältige Entwicklungen zur Folge. So hat es an Versuchen, die mit oft beträchtlichen Material- und Zinsverlusten verbundene Fasslagerung von Spirituosen durch Maßnahmen einer „künstlichen Reifung“ zu beschleunigen oder gar zu ersetzen, nie gefehlt (WÜSTENFELD und HAESELER, 1964, S. 365). Folgende Verfahren von Alterungstechniken lassen sich hierbei anführen: 3.4.3.1 Alterungsverfahren durch Wärmeeinwirkung Der Erhitzung von alkoholischen Getränken in Druckbehältern auf Temperaturen über ihren Siedepunkt liegt der Gedanke zugrunde, dass die bei gewöhnlicher Temperatur langsam verlaufenden Prozesse der Bukettbildung beschleunigt werden. Zudem wird davon ausgegangen, dass bei geeigneter - 32 - Der Vergleich von P mit alkoholischen Getränken ist schwierig Theoretischer Teil: Reifungstechniken bei alkoholischen Getränken Prozessführung Branntweine von leichtest flüchtigen, „unreinen“ Nebenbestandteilen befreit werden können (WÜSTENFELD und HAESELER, 1964, S. 366). 3.4.3.2 Alterungsverfahren durch Oxidationsmittel und durch Bewegung Bei Alterungsverfahren dieser Art liegen neben den oxidativen Einflüssen von in das Reifungsgut eingeleitetem Sauerstoff oder Ozon, deren Wirkung nur schlecht spezifischen, definierten Stoffklassen zugeordnet werden können, wiederum Prozesse vor, die bei Vergrößerung der Produktoberfläche durch starke Bewegung bis hin zur Zerstäubung zu erhöhten Übergangsraten leichtest flüchtiger, u.U. sensorisch störender Verbindungen in die Gasphase führen. 3.4.3.3 Alterungsverfahren durch Ultraschall Die Anwendung von Ultraschallwellen kann zum einen im Produkt zu einer Temperaturerhöhung, zum anderen zu einer Stabilisierung von FlüssigkeitGas-Gemischen führen. Letzteres kann sowohl die Löslichkeit von eingeleiteten Gasen durch eine „Zerstäubung“ der Gasperlen temporär verbessern und so z.B. die oxidative Wirkung oben beschriebener Zusätze erhöhen als auch das Ausgasen leichtest flüchtiger Verbindungen begünstigen. Da die Dosierung von Ultraschallwellen, die eine oft drastische Wirkung auf das Gesamtaroma besitzen, schwer fällt, hat sich dieses eigentlich potente Reifungsverfahren nicht etablieren können (WÜSTENFELD und HAESELER, 1964, S. 369). 3.4.3.4 Alterungsverfahren durch Einfluss von Chemikalien und Katalysatoren Nach WÜSTENFELD und HAESELER (1964, S.370) sind unter dem Begriff „Chemikalien“ Substanzen zu verstehen, die eine Reifung durch Sauerstoffabspaltung bzw. aufgrund ihres oxidativen Potentials beschleunigen können. Es werden Verbindungen wie Mangan-, Barium- oder Wasserstoffperoxid, aber auch Permanganatsalze und Schwefelsäure aufgeführt. Des Weiteren werden Metallpulver und –späne (Aluminium, Nickel, Blei) bzw. Metalloxide (Eisen, Kupfer, Blei) zur Beschleunigung der Reifung von Spirituosen oder des eingesetzten Prima Sprits vorgeschlagen. Silberkatalysatoren („Oxy-Esterator“®) führen nachweislich zu einer leichten Erhöhung des Esteranteils und zu einer geringen Abnahme des Säurewertes, was sich positiv auf den Gesamteindruck des Produktes auswirkt. (FREY, 1934, S. 419; KATADYN GmbH, 1979, S. 82-83). - 33 - Theoretischer Teil: Zusammenfassung der Erkenntnisse 3.5 Zusammenfassung der Kenntnisse über Aromaveränderungen in P Über das zu untersuchende Phänomen der Geruchsveränderung von P sind vor dieser Arbeit keine Untersuchungen durchgeführt worden, die zur Eingrenzung oder gar Klärung der Fragestellung hätten herangezogen werden können. Da zudem keine Aussagen in der einschlägigen Fachliteratur über aromarelevante Aspekte der im vorliegenden Fall beteiligten Arzneipflanzen und Heilkräutern vorliegen, ist es im Vorfeld nicht möglich, konkrete Ansatzpunkte und mögliche Erklärungen für die Ursachen des Zustandekommens der beiden olfaktorischen Geruchszustände und der Veränderungen während der Lagerzeit zu finden. Analogieschlüsse zu Lebensmitteln im Allgemeinen und alkoholischen Getränken im Speziellen sind nur eingeschränkt möglich. Mögliche Ursachen der Aromaveränderungen an P sind schwer eingrenzbar Wie im Kapitel 3.2 (S. 23) erläutert, muss davon ausgegangen werden, dass die geruchlichen Verbesserungen an P durch eine Abnahme der Konzentration an Fehlgeruchsstoffen, durch die Bildung von positiv empfundenen Aromakomponenten bzw. durch eine Kombination aus beiden Prozessen bedingt sein können. Beobachtungen bei der Wahrnehmung und der Beeinflussung ähnlich gelagerter Fälle im Lebensmittelbereich lassen Vermutungen zu, dass der anfängliche Geruchszustand durch leichtest flüchtige Fehlgeruchssubstanzen bedingt sein kann. Hinweise für die Gegenwart von Fehlgeruchsstoffen Da der Geruchseindruck im verdünnten Zustand bei jungen wie gelagerten Proben gleich ist, muss eine Gehaltszunahme von positiv bewerteten Geruchsstoffen als Grund für die Geruchsverbesserung als eher unwahrscheinlich angesehen werden. Hierfür spricht auch der bereits frühzeitig erkannte Einfluss von Aktivkohle auf den Fehlgeruch. Die Geruchsverbesserung nach Wasserzusatz wäre z.B. somit durch die Verminderung der Übergangsraten relativ polarer Verbindungen in den Dampfraum über P erklärbar (vgl. auch „Fugazität“ bei realen Gasen, ATKINS, 1990, S. 134; BRDICKA, 1985, S. 433). Die offenbar relativ hohe Polarität muss aber zunächst im Widerspruch zu der beobachteten hohen Flüchtigkeit gesehen werden. Die Geruchsverbesserung ließe sich nämlich auch mit der Verschiebung des Verteilungsgleichgewichts von unpolaren, olfaktorisch positiv empfundenen, ätherischen Ölkomponenten in den Gasraum über P deuten (ZIEGLER und ZIEGLER, 1998, S. 402-406). Zu Beginn der Untersuchungen können daher sowohl eine Beteiligung aromabildender Prozesse als auch eine Kombination aus sinkenden wie steigenden Gehalten an Geruchsstoffen als Ursache des zu untersuchenden Phänomens nicht ausgeschlossen werden. - 34 - Aromabildene Prozesse können nicht ausgeschlossen werden Theoretischer Teil: Zusammenfassung der Erkenntnisse Alle Prozesse, die geruchsverbessernden, aromabildenden Veränderungen zuzuordnen sind, können einschränkend „nur“ aus der Gruppe der Substanzen generiert werden, die durch die Destillation in das Untersuchungsmaterial P gelangen. Diese Veränderungen sind aber maßgeblich für die Bewertung der Stabilität des Produktes von Bedeutung. Aus diesem Grund muss allen Hinweisen nachgegangen werden, die "anabolen", aromaverbessernden Prozessen zugeordnet werden können. Letztendlich können die Ursachen der Veränderungen sehr vielfältig sein Die nicht einheitliche Wirkcharakteristik von Phytopharmaka ist eine Funktion ihrer komplexen Zusammensetzung. Da die Anzahl an potentiellen Aromaverbindungen im eingesetzten Drogenmaterial noch größer ist als in P selbst, können Aussagen über mögliche stoffliche Ursachen des Geruchsphänomens nur spekulativer Art sein. Eingrenzend kann lediglich vermutet werden, dass die geruchlichen Veränderungen durch chemische und/oder physikalische Prozesse verursacht werden müssen. So könnten z.B. Oxidationen, Hydratisierungen von ungesättigten Bindungen, Cyclisierungsreaktionen, Hydrolysen oder Veresterungen, wie sie beispielsweise CLARK und CHAMBLEE (1992, S. 229-285) oder OHLOFF (1990) beschreiben, bzw. adsorptive Effekte oder das bloße Ausgasen flüchtiger Verbindungen maßgeblich an den beobachteten, olfaktorischen Veränderungen beteiligt sein. Die Fragestellung dieser Arbeit erfordert daher eine umfassende experimentelle Analyse der chemischen Inhaltsstoffe des Destillats sowie eine Bewertung der ablaufenden Veränderungen vor dem Hintergrund ihrer sensorischen Bedeutung. - 35 - Theoretischer Teil: Analytik von Geruchsstoffen 3.6 Analytik von Geruchsstoffen Um die in P ablaufenden olfaktorischen Veränderungen auf stoffliche Prozesse zurückführen zu können, muss neben den instrumentell-analytischen Daten vor allem die sensorische Relevanz der einzelnen, flüchtigen Stoffe untersucht werden. Obgleich in den letzten Jahren die Entwicklung von Gassensoren, sogenannten "künstlichen Nasen", große Fortschritte gemacht hat (SCHEPPER und DANIELS, 1997, S. 245-255; KELLER und MEYER, 1997; KEDING und HÖGER, 1996, PHARMAZEUTISCHE INDUSTRIE, 1997, S. 779; HORNER, 1998, S. 538-542; KUMPMANN, 1998, S. 267-273), können diese Systeme bisher nur mehr oder weniger detaillierte Analysenprofile von Gasgemischen aufzeichnen (vgl. BRUHN, 1990, 213 ff.). Hedonische Informationen, also subjektive Wertungen von Geruchseindrücken im Sinne von „gut“ oder „schlecht“ (Beliebtheitsprüfungen), wie sie das Verfahren der Gaschromatographie-Olfaktometrie (GCO, vgl. Kapitel 3.6.1, S. 36) liefern kann, können solche Geräte z.Zt. nur sehr bedingt erzeugen. Rein instrumentelle Untersuchungen, die stoffliche Veränderungen belegen, zeigen nur notwendige Randbedingungen der eigentlich für die Aromaveränderung verantwortlichen Konzentrationsverschiebungen auf. Da aber die Unterschiede zwischen einem angenehmen und einem unangenehmen Geruchszustand aufgedeckt werden sollen, ist es unumgänglich, den olfaktorischen Charakter der geruchsaktiven Komponenten in P bewerten zu können. Nur die Kenntnis der Geruchsaktivität und –charakteristik der einzelnen Verbindungen in P kann zur Lösung der gestellten Aufgabe beitragen. Die Analysentechnik der Wahl zur Klärung dieser Frage, welche Substanzen an der Ausprägung eines Aromas beteiligt sind, stellt daher die Kombinationstechnik GCO dar, die zu den effektivsten Analysenmethoden auf dem Gebiet der Untersuchung spezieller Fragestellungen der Aromastoffchemie zählt (vgl. MATSUI et al., 1998, S. 51 ff.; GUTH, 1997, S. 3022, 3024; KERSCHER und GROSCH, 1997, S. 3-6; MASANETZ et al., 1998, S. 108, GUTH und GROSCH, 1993, S. 173). 3.6.1 Gaschromatographie-Olfaktometrie (GCO) Bei der GCO, auch „Sniffing-Analyse“ genannt, wird die große Trennleistung der hochauflösenden Kapillargaschromatographie mit der menschlichen Nase als analytischer Detektor kombiniert (Abb 3-3). - 36 - „Künstliche Nasen“ GCO Theoretischer Teil: Analytik von Geruchsstoffen Abb. 3-3: Schematische Darstellung einer Sniffinganalyse Nase Injektor Aromagramm Sniffingport Chromatogramm FID Aromagramme mikro- und makroolfaktore Merkmale Die aus den GCO-Untersuchungen resultierenden Geruchsassoziationen werden in sogenannten „Aromagrammen“ oder „Olfaktogrammen“ (RÖMPP LEBENSMITTELLEXIKON, 1995, S. 72; SCHIEBERLE et al., 1990, S. 193; ULRICH, 1999) über die Zeit aufgetragen. Aromagramme weisen aus, ob und wie eine von der analytischen Trennsäule eluierte Substanz geruchlich wahrgenommen wird. Die dabei auftretenden Geruchsassoziationen werden im Folgenden auch als "mikro-olfaktorische Merkmale" bezeichnet. Diese sind von den „makro-olfaktorischen Geruchsmerkmalen" zu unterscheiden, die die Gesamtheit der Geruchswahrnehmungen von P während einer Verkostung beschreiben. Zweckmäßigerweise werden die wahrgenommenen Geruchsassoziationen auf ein simultan aufgezeichnetes Chromatogramm übertragen. Meist handelt es sich hierbei um ein konventionelles, im vorliegenden Fall mit einem Flammionisationsdetektor (FID) aufgezeichnetes Chromatogramm. Dabei kann die Beobachtung gemacht werden, dass aufgrund der unterschiedlichen Sensitivität der beiden „Detektorsysteme“ z.B. ein Geruch am Sniffingport wahrgenommen wird, ohne dass ein FID ein Signal erzeugt. Umgekehrt können Majorkomponenten im Chromatogramm für die menschliche Nase nicht wahrnehmbar sein. Systemsynchronie und MarkerSubstanzen Zur Prüfung der Synchronie beider Detektorsysteme sind Substanzen besonders geeignet, deren Geruch im Aromagramm und deren Auftreten im Chromatogramm eindeutig erkannt werden kann. Die Verteilung solcher „MarkerSubstanzen" über weite Teile des Retentionsbereiches ist anzustreben, um die einwandfreie Funktionalität des Sniffing-Ports zu gewährleisten. Zur orientierenden Identifizierung der geruchlich aktiven Substanzen dienen Massenspektren, die von den Untersuchungsmustern mittels Gaschromatographie/Massenspektrometrie (GC/MS) aufgenommen werden. - 37 - Theoretischer Teil: Analytik von Geruchsstoffen Die Spezifität der den Geruchswahrnehmungen zugeordneten Massenspektren gibt in Verbindung mit Spektrenbibliotheken erste Hinweise auf die Identität der geruchlich interessanten Verbindungen. Eine simultan arbeitende GCO-MS-Verbindung ist wegen des am Sniffing-Port herrschenden Luftdrucks und dem Hochvakuum in der Ionenquelle des Massenspektrometers aus drucktechnischen Gründen nicht möglich. Um die Ergebnisse der Sniffing-Analyse den Massenspektren sicher zuzuordnen, sind FID-Chromatogramme daher üblicherweise unerlässlich. Der Vergleich der Retentionszeit, des Massenspektrums und des Geruchs mit einer Referenzsubstanz führt letztendlich zu einer eindeutigen Identifizierung der im Aromagramm ausgewiesenen Aromakomponenten. 3.6.2 Hinreichende Bedingungen der Identifizierung von Geruchsstoffen mittels GCO Um die GCO-Technik erfolgreich anwenden zu können, müssen zwei Voraussetzungen erfüllt sein: 1. Die für das zu untersuchende Phänomen verantwortlichen Substanzen müssen bei der GCO-Untersuchung über der Geruchsschwelle für den Menschen liegen und Abb. 3-4: Hinreichende Bedingungen der Identifizierung von Geruchsstoffen mittels GCO 2. der bei der GCO registrierte Geruch muss dem gesuchten Geruchseindruck zuordenbar sein. Die erste Voraussetzung kann theoretisch beeinflusst werden. So können verschiedene Anreicherungstechniken wie z.B. flüssig-flüssig Extraktionen, Destillationen oder Purge-and-Trap-Techniken angewendet werden, um zu gewährleisten, dass die Konzentration der geruchsaktiven Substanz(en) am Sniffing-Port über der Erkennungsschwelle liegt. Allerdings müssen bei der Untersuchung der vorliegenden Geruchsprofile die Kriterien für eine fehlerfreie Isolierung und Anreicherung von Aromakomponenten ganz besonders beachtet werden. Nur wenn der unangenehme oder der angenehme produkttypische Geruch im Aromakonzentrat erhalten bleiben, kann von einer Anreicherung gesprochen werden und können grobe Veränderungen des jeweiligen Geruchsprofils ausgeschlossen werden. Grobe Veränderungen bei Geruchsprofilen können zum einen Verschiebungen in der Zusammensetzung der Aromakomponenten unter Ausschluss (Dis- - 38 - Anreicherungen von Aromastoffen: notwendig, aber verfälschend ? Theoretischer Teil: Analytik von Geruchsstoffen kriminierung) wesentlicher Aromafraktionen, zum anderen Artefaktbildungen darstellen (vgl. REINECCIUS und LIARDON, 1985, S. 130; CHIN und LINDSAY, 1993, S. 835 ff., SPANIER et al., 1994, S. 49-62). Da Verschiebungen in der Zusammensetzung eine Grundvoraussetzung jeder Anreicherungstechnik und Artefaktbildungen bei keiner Konzentrierungstechnik auszuschließen sind (vgl. PEISELER-SUTTER, 1995, S.7), müssen stets verschiedene Anreicherunsgtechniken angewendet werden, um falsch positive oder falsch negative Ergebnisse zu vermeiden (BELITZ und GROSCH, 1992, S. 309). Bei besonders flüchtigen Substanzen können heute in der Aromastoffchemie automatisierte Strip-and-Trap- oder Closed-Loop-Stripping-Techniken angewendet werden. Bei diesen Techniken werden vor allem die Komponenten im Gasraum über der Probe konzentriert. Meist werden die Konzentrate direkt nach Erzeugung der gaschromatographischen Analyse zugeführt (Thermodesorption nach Adsorption an porösen Trägerstoffen wie Aktivkohle oder Kunststoffpolymere [z.B. Tenax®, Chromosorb® u.a.] bzw. in Kühlfallen; vgl. BURMEISTER et al., 1992, S. 56; MacLEOD und AMES, 1986, S. 393 ff.). Aufgrund der Flüchtigkeit der interessierenden Verbindungen und der zumeist gestellten Frage nach Aromastoffen und nicht nach Aromaprofilen wird das Konzentrat in den seltensten Fällen „makro-sensorisch“ untersucht. Deuterierte Isotope bekannter Aromastoffe können als interne Standardsubstanzen hierbei zwar Verluste bei der Quantifizierung der betreffenden Aromakomponente aufdecken (MASANETZ und GROSCH, 1998, S. 114-120; ZEHENTBAUER und GROSCH, 1997, S. 262; SEN et al., 1991, S. 757), bei der Charakterisierung von Geruchsprofilen können aber unbemerkt auftretende Verluste oder Veränderungen von Aromakomponenten das Ergebnis der GCO-Untersuchung verfälschen (z.B. FORNEY et al., 1991, S. 2258; REINECCIUS und LIARDON, 1985, S. 130; CHIN und LINDSAY, 1993, S.835, 836). Aus diesem Grund ist die Anreicherungstechnik bei der Untersuchung von definierten sensorischen Merkmalen wie im vorliegenden Fall nicht zwingend geeignet. Zu hohe Anreicherungsraten können überdies zu Schwierigkeiten der chromatographischen Trennung führen. Die Trennleistung des Systems muss ausreichend sein, um an konzentrierten Aromaextrakten diskrete Geruchswahrnehmungen zu gewährleisten. Die Frage, ob ein Untersuchungsmaterial optimal für die GCO-Untersuchung von Geruchsprofilen angereichert worden ist, kann also vorab nie wirklich beantwortet werden. Wesentlicher ist, ob die GCO-Untersuchungen an einer bestimmten Extraktstufe überhaupt Lösungen für die vorliegende Problemstellung anbieten können. Grundsätzlich muss bei der Untersuchung von konkreten Geruchsprofilen Anreicherungstechniken mit Vorsicht begegnet werden, wenn der Erhalt des Charakters des Geruchsmusters nach der Konzentrierung anzuzweifeln ist. Nur wenn das Konzentrat den sensorischen Identi- - 39 - Theoretischer Teil: Analytik von Geruchsstoffen tätsvergleich mit dem Ausgangsmuster besteht, ist eine weitere GCO- und GC/MS-Untersuchung angezeigt und sinnvoll (NEUMANN und MOLNÁR, 1991, S. 83). Die zweite Voraussetzung für die erfolgreiche Anwendung der GCO, die Zuordenbar- und Bewertbarkeit der Geruchseindrücke, ist von der Natur der Duftstoffe abhängig und damit nicht beeinflussbar. Zur Beantwortung der vorliegenden Fragestellung müssen theoretisch die mikro-olfaktorischen Merkmale potentieller Geruchsstoffe im Aromagramm den entsprechenden makro-olfaktorischen Zuständen zugeordnet werden können, d.h. die Wahrnehmung der mikro-olfaktorischen Merkmale muss eine Wertung und eine Einteilung in angenehme und unangenehme Reize zulassen. Da dabei mögliche Aromavariationen durch eine gegenseitige Beeinflussung von Aromastoffen während der makro-olfaktorischen Reizerzeugung sowie die Abhängigkeit der subjektiven Geruchswahrnehmung von der Konzentration nicht berücksichtigt werden können, könnte eine sichere Auswahl der für die Fragestellung relevanten Duftstoffe alleine durch die GCO nur bedingt oder gar nicht möglich sein. Geruchsprofiluntersuchungen durch fraktionelle Geruchsstoffanalytik müssen nicht unbedingt erfolgreich sein Aufgrund dieser Schwierigkeiten bei der Untersuchung von Geruchsmustern müssen andere Verfahren helfen, die Unwägbarkeiten der Zuordnung und Verknüpfung subjektiv olfaktorischen Merkmale zu objektivierbaren stofflichen Veränderungen zu minimieren. Ein derartiges Verfahren ist mit der Aromaextraktverdünnungsanalyse gegeben, ein anderes mit der Festlegung bzw. „Erzeugung“ von definierten makroolfaktorischen Zuständen, zwischen denen stoffliche Veränderungen gezielt sensorisch wie instrumentell untersucht werden können. 3.6.3 Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) Eine Technik, die die aromaprägenden Komponenten eines olfaktorisch aktiven Vielstoffgemisches aus der Gesamtzahl der Aromastoffe selektieren kann, stellt die Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) dar (vgl. ACREE, 1993, S. 9, GROSCH, 1987, S. 277; SCHIEBERLE, 1990, S. 193; ETIÈVANT et al., 1994, S. 179; REINERS und GROSCH, 1998, S. 2754-2763; TRIQUI und REINECCIUS, 1995, S. 453-458). Bei diesem Verfahren werden Verdünnungen von Aromaextrakten mit Hilfe der GCO untersucht. Die Extrakte werden dabei in immer größeren Verdünnungen injiziert und "abgerochen". Die Verdünnungsschritte werden so lange fortgesetzt, bis nur noch wenige und schließlich keine Aromakomponenten im Aromagramm mehr wahrgenommen werden können. Mit diesem Verfahren lassen sich in einfacher Weise die am meisten aromaintensiven Substanzen eines Duftstoffgemisches ermitteln. Die Theorie besagt, dass diejenigen Substanzen, die die höchsten Verdünnungsfaktoren in einem Gemisch besitzen, auch den Charakter eines Geruchszustandes am stärksten prägen. - 40 - AEVA ermittelt prägende Geruchsstoffe Theoretischer Teil: Analytik von Geruchsstoffen Eine der Schwierigkeit der GCO-Anwendung auf das vorliegende Problem stellt die Verknüpfung und Zuordnung der mikro-olfaktorischen Merkmale der Probe P mit den beiden makro-olfaktorischen Zuständen „mit“ und „ohne Fehlgeruch“ dar. Mit Hilfe der AEVA-Technik sollte es möglich sein, die Ursache der Geruchsverbesserung auf die Zunahme positiv oder/und die Abnahme negativ empfundener Geruchsstoffe einzugrenzen. 3.6.4 Hinreichende und notwendige Bedingungen der Identifizierung von problemrelevanten Geruchsstoffen in P Grundsätzlich müssen zunächst alle mikro-olfaktorischen, aber auch instrumentell detektierbaren Substanzen als potentielle Lösungen für die zu untersuchende Fragestellung angesehen werden. Die sensorische Identifikation einer möglicherweise für das zu untersuchende Phänomen verantwortlichen Substanz ist allerdings nur eine hinreichende Bedingung. Problemrelevante Stoffe müssen Gehaltsveränderun gen erleiden Problemrelevante Stoffe müssen in P über ihrer Geruchsschwelle enthalten sein Problemrelevante Stoffe müssen sich selektiv beeinflussen lassen und Geruchsveränderungen an P bedingen Eine notwendige Voraussetzung stellt hingegen die Veränderung des detektierbaren Reizes/Signals dar, die mit den variablen makro-olfaktorischen Geruchszuständen originärer Proben verschiedener Chargen korrelierbar sein muss. Nur wenn auch die sensorische oder stoffliche Veränderung zwischen diesen Zuständen objektiv für eine potentielle Geruchssubstanz nachweisbar ist, kann die Substanz als Teil der Lösung der gestellten Aufgabe angesehen werden. Dass P als Naturprodukt natürlichen Schwankungen der Zusammensetzung unterliegen kann, bedarf bei der Feststellung der makro- und mikroolfaktorischen bzw. instrumentell-analytischen Merkmale der Beachtung. Eine weitere notwendige Bedingung für die Identifizierung eines prägenden Duftstoffes stellt sein Geruchsschwellenwert im Untersuchungsmaterial dar. Nur wenn die in der Probe nachgewiesene Konzentration des selektierten Geruchsstoffes über der Geruchsschwelle liegt, kann die Substanz überhaupt einen Beitrag zum Aroma leisten (Aromawert > 1). Bei der Feststellung der Geruchsschwelle wird das bei Raumtemperatur in einem verschlossenen Verkostungsglas sich einstellende Verteilungsgleichgewicht des Duftstoffes zwischen Matrix und Atmosphäre berücksichtigt. Nur diese Daten lassen Aussagen über das bei gleichen Bedingungen auffällig gewordene Geruchsphänomen zu. Ferner sollten sich die auf diese Weise selektierten Verbindungen durch gezielte Maßnahmen beeinflussen lassen. Durch solche Einflüsse geschaffene makro-olfaktorisch unterscheidbare Zustände müssen sich dann instrumentellanalytisch, objektiv in der stofflichen Veränderung der selektierten Substanz oder Substanzen unterscheiden lassen, wobei die Veränderungen die Konzentrationsbereiche der Geruchs- bzw. Erkennungsschwelle der betrachteten Substanz „tangieren“ oder „überstreichen“ müssen. Der bereits erwähnte Einfluss von Wasser bzw. die Anwendung önologischer Verfahren zur Beschleunigung oder Maßnahmen zur Verlangsamung der zu untersuchenden Prozesse gehören so zu probaten Mitteln, neue Zustände und Vergleiche an P zu - 41 - Theoretischer Teil: Analytik von Geruchsstoffen schaffen (vgl. Kapitel 4.1.3, S. 48). Die dadurch eröffnete Möglichkeit, aus einer Charge mehrere olfaktorische Zustände vergleichen zu können, reduziert die natürlicherweise möglichen Chargenunterschiede der Zusamensetzung auf ein Minimum. Je mehr Verknüpfungen zwischen makro-olfaktorischen Zuständen und objektiv analytischen Veränderungen auf diese Weise hergestellt werden können, um so größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass es sich bei den subjektiv olfaktorisch selektierten Verbindungen um die für die zu untersuchenden Veränderungen an P tatsächlich verantwortlichen Aromastoffe handelt. Im Idealfall müssen sich die während der Reifeperiode beobachteten Veränderungen gezielt durch Zugabe oder Entfernung der selektierten Verbindung(en) sowohl in die Richtung des besseren sowie des schlechteren olfaktorischen Zustandes steuern lassen. - 42 - Experimenteller Teil: Material 4. Experimenteller Teil 4.1 Material In den folgenden Kapiteln wird schematisch dargestellt, wie das Untersuchungsmaterial P hergestellt und für die instrumentell-analytischen bzw. instrumentell-olfaktorischen Untersuchungen aufgearbeitet wird. Die zur Klärung der Frage angewendeten Methoden und Analysenverfahren werden in Kapitel 4.2 ab S. 50 erläutert. 4.1.1 Herstellungsschema des Untersuchungsobjekts P Vorbereitung der Ausgangsdrogen: Einzeldrogen Einwaage Drogenmühle Drogenmischung Destillation: Drogenmischung 1. Destillation 2.Destillation Alkohol Wasserkühlung Wasser P Vorlagetank 1. Filtration 1. Lagerung Urteil positiv Verkostung Urteil negativ 2. Filtration 2. Lagerung Verkostung Konfektionierung P - 43 - Experimenteller Teil: Probenvorbereitung, Anreicherungsverfahren 4.1.2 Probenvorbereitung: Anreicherungsverfahren Die Charakterisierung und Identifizierung von Geruchsstoffen stellt hohe Anforderungen an die Analysentechnik. Dies ist zum einen in der hohen Flüchtigkeit der Verbindungen, zum anderen durch die teilweise vorliegenden, geringen Stoffkonzentrationen bedingt. Um sicherzustellen, mikro-olfaktorisch relevante Unterschiede des Untersuchungsmaterials voll erfassen zu können, wurden verschiedene Anreicherungstechniken angewendet. Neben der relativ artefaktarmen, wenn auch unempfindlichen Headspace-Probenaufgabe-technik wurden weitere, unterschiedliche Anreicherungstechniken auf ihre Eignung für den vorliegenden Fall überprüft. 4.1.2.1 Destillative Anreicherungen von P Die naheliegendste Aufarbeitung von P stellte die erneute Destillation des Destillats dar. Für die Konzentrierung von Duftstoffen aus Proben „mit“ und „ohne“ Fehleindruck wurde eine Labordestille gemäß dem Europäischen Arzneibuch 2.2.11 verwendet. Aufgrund der vermuteten hohen Flüchtigkeit potentieller Fehlgeruchsstoffe wurden Destillationsgeschwindigkeiten von ca. 1 ml/min und kurze Destillationszeiten zwischen 10 und 30 Minuten gewählt, um die angereicherten Verbindungen möglichst schnell analysieren zu können. Die Anreicherungsfaktoren lag dabei zwischen 2 und 50. Der Probeneinsatz an P mit verschiedenen makro-olfaktorischen Merkmalen betrug 50 bis 500 ml. Bei der Aufarbeitung zweier olfaktorischer Zustände von P musste reproduzierbar gearbeitet werden, um die Nivellierung von Geruchsunterschieden aufgrund unterschiedlicher Wassermengen im Destillat vernachlässigen zu können. Destillate aus den eingesetzten Drogen wurden mit einer Apparatur nach dem Europäischen Arzneibuch 2.9.10 gewonnen, wobei zusätzlich eine 50 cm langen Vigreux-Kolonne zwischen Rundkolben und Übergang eingesetzt wurde. Diese Modifikation diente sowohl der Unterstützung der Anreicherung leichtest flüchtiger Komponenten als auch der Verlängerung der Destillationszeiten. Bei allen Drogendestillationen wurde darauf geachtet, dass das in der Produktion eingehaltene Verhältnis Drogen : Destillat um mindestens eine Größenordnung übertroffen wurde. - 44 - Abb. 4-1: Destillationsapparatur gemäß Ph. Eur. 2.9.10 Experimenteller Teil: Probenvorbereitung, Anreicherungsverfahren Auch wurde der Wasseranteil während der Destillation zur Verlängerung der Erhitzungsdauer erhöht. Eine Standardisierung des Alkoholgehaltes der Drogendestillate erfolgte bei vergleichbaren Anreicherungsbedingungen nicht. Bei den destillativen Anreicherungen wurde besonders auf die Kühlung der Vorlage und die direkte Einleitung des Kondensats in 50%igen Ethanol geachtet. Der höhere Wasseranteil in der Vorlage sollte den möglicherweise vorhandenen „retardierenden“ Einfluss von Wasser auf potentielle Fehlgeruchssubstanzen verstärken. Während bei der Produktion von P Kühlwassertemperaturen von bis zu 40 °C toleriert werden können, wurde im Labor stets unter 0 °C mit Eis/Kochsalz-Gemischen bzw. bei –75 °C mit Isopropanol/Trockeneis gekühlt. Diese Maßnahmen sollten vor allem helfen, leichtest flüchtige Verbindungen mit größeren Ausbeuten zu kondensieren. Als Wärmequelle bei den Destillationen diente ein elektrisch beheizbares Wasserbad. Die auf diese Weise gewonnenen Konzentrate wurden sowohl makro- und mikro-olfaktorisch mittels GCO und AEVA als auch instrumentell-analytisch (HRGC/MS, HRGC/HRMS) untersucht. Die genauen Analysenparameter und Geräteeinstellungen während der Untersuchungen werden ab S. 51, beschrieben. Die Ergebnisse der Untersuchungen werden in Kapitel 5.2.1, S. 72, aufgeführt. 4.1.2.2 Extraktive Anreicherungen Durch flüssig-flüssig Extraktion können Substanzen aus einer flüssigen Matrix durch die Wahl eines geeigneten, mit der flüssigen Probe nicht mischbaren, Extraktionsmittels durch Ausschütteln angereichert werden. Hierbei wurden 100 ml einer unangenehm riechenden, jungen Probe in einem Scheidetrichter mit 20 ml n-Pentan überschichtet und anschließend kräftig geschüttelt. Nach 20-minütiger Phasentrennung wurde die untere, alkoholische Phase in ein Verkostungsglas gefüllt und die Pentan-Phase bei Atmosphärendruck und Raumtemperatur eingeengt. Sowohl die extrahierte Phase als auch der extrahierte Rückstand wurden einer makro-olfaktorischen Bewertung. Das Ergebnis der Untersuchung ist in Kapitel 5.2.2, S. 73, zu finden. 4.1.2.3 Kondensationen in Kühlfallen Die Kondensation der Dampfraumphase in Kühlfallen (dynamische Headspace-Analyse) stellt eine Zwischenstufe zwischen der Destillation und der reinen statischen Dampfraumanalyse dar. Theoretisch eignet sich diese Methode gut, um größere Dampfmengen zu konzentrieren. Hinsichtlich eines - 45 - Experimenteller Teil: Probenvorbereitung, Anreicherungsverfahren möglichen Artefaktbildungspotentials, z.B. hervorgerufen durch Reaktionen mit dem Wandmaterial der Kühlfalle, ist diese Technik aber der destillativen Anreicherung ähnlicher als der statischen Headspace-Analyse, da das Konzentrat ebenfalls in kondensierter Form vorliegt. Purge-and-Trap bzw. Strip-and-Trap-Versuche wurden mit einem 6-Port-Ventil durchgeführt (dynamische Headspace-Analyse), an das eine Leitung für die Trägergasversorgung und die analytische Trennsäule angeschlossen wurden. Als Probenschleifen wurden verschiedene Materialien verwandt, um Einflussnahmen des Wandmaterials auf möglicherweise reaktive, aromarelevante Verbindungen in der kondensierten Phase zu variieren und vergleichen zu können. Neben Polytetrafluorethylenkapillaren (PTFE, 800 µl) wurden Polyetheretherketon- (PEEK®, 450 µl) und Edelstahlkapillaren (SS304 Hamilton, 320 µl) verwendet. Gekühlt wurde mit Trockeneis/Isopropanol bei ca. –75 °C. Bei Kondensationsexperimenten, bei der die Probenschleife mit flüssigem Stickstoff (-195 °C) gekühlt worden war, überwogen Probleme mit kondensiertem Trägergas die Vorteile der Tieftemperatur-Kondensation. Techniken der präparativen GC (Kryofokussierung) konnten aus apparativen Gründen nicht angewendet werden. Bei diesen Versuchen wurde versucht, möglichst große Volumina des Dampfraumes über P zu konzentrieren. Dabei wurden 100 ml der Probe mit einem definierten makro-olfaktorischen Zustand in einer Gaswaschflasche über eine Glassinterfritte (Porosität No.1) mit Argon durchspült bzw. der Dampfraum über der Probe abgeleitet. Die Durchflussvolumina des Spülgases lagen zwischen 5-10 ml/min, die „Ladezeiten“ der Kühlschleifen zwischen 10-60 min. Laden Injizieren Trägergas Trägergas Trennsäule Einlass Trennsäule Einlass Auslass Auslass Probenschleife DEWAR-Gefäß Probenschleife DEWAR-Gefäß kalt warm - 46 - Abb. 4-2: Schema der Ventilschaltung beim Gebrauch von Kühlschleifen, dynamische Headspace-Analyse Experimenteller Teil: Probenvorbereitung, Anreicherungsverfahren In Abbildung 4-2 werden der Versuchsaufbau der dynamischen HeadspaceAnalyse und die beiden Ventilstellungen während der „Beladung“ der Probenschleife und der Injektionsphase dargestellt. Die Kondensate wurden direkt mittels HRGC/MS untersucht, die Ergebnisse sind in Kapitel 5.2.3 auf S. 73 dargestellt. 4.1.2.4 Festphasen-Mikroextraktion (SPME) Eine weitere Technik zur Untersuchung von flüchtigen Substanzen in flüssigen wie gasförmigen Proben stellt die Festphasen-Mikroextraktion (SPME) dar. Hierbei werden flüchtige Substanzen an einer Fused-Silica-Faser, die mit Phasen unterschiedlichster chemischer Konstitution, Schichtung sowie Filmdicken belegt sind, ad- bzw. absorbiert und damit angereichert. Bei den Untersuchungen wurde eine speziell für schwefelhaltige Verbindungen entwickelte Carboxen-Phase (100 µm FD) verwendet. Nachdem sie bei 250 °C ausgeheizt und konditioniert worden war, wurde sie ausschließlich im Dampfraum bei Raumtemperatur über unangenehm riechenden Proben ein gesetzt. Die Equilibrier-(Belade-)zeiten lagen zwischen 10 und 120 min. Abb. 4-3: SPME-Aufgabegerät links: Gesamtansicht, rechts: vergrößerter Querschnitt Die Anreicherung, die theoretisch auch aus der flüssigen Phase erfolgen kann, wurde nur in der Gasphase angewendet, da die hohe Alkoholkonzentration in P den Kleber der SPME-Faserhalterung angegriffen hätten. Die Desorption der Verbindungen erfolgte thermisch direkt im Injektor des GCs. Hierfür wurde die SPME-Faser innerhalb der Schutznadel durch das Septum - 47 - Experimenteller Teil: Verfahren zur Beeinflussung des Fehleindrucks des Injektors gestochen. Durch Herausschieben der Faser begann bei 220 °C und geschlossenem Split die Desorptionsphase für 30 bis 60 s. Längere Desorptionszeiten von bis zu 5 min hätten nur mit Hilfe einer Kryofokussierung realisiert werden können. Da bei dieser Anreicherungsart weniger die Konzentrierung als die Matrixausblendung im Vordergrund steht, wurden mit dieser Aufgabetechnik keine GCO-, sondern nur HRGC/MS-Untersuchungen durchgeführt. 4.1.2.5 Headspace-Analyse (HS) Nicht zuletzt stellt auch die statische Headspace-(Dampfraum-)analyse ein Anreicherungsverfahren für leichtest flüchtige Verbindungen dar. Sie wird im Kapitel 4.2.5.3, S. 61, Headspace-Gaschromatographie, näher erläutert. 4.1.3 Verfahren zur Beeinflussung des Fehleindrucks an P Behandlungsverfahren, die es erlaubten innerhalb einer Charge von P unterschiedliche olfaktorische Zustände zu erzeugen, spielten bei der Überprüfung der Richtigkeit der Zuordnung und Identifizierung olfaktorischer Reize eine wesentliche Rolle. Zu diesen Behandlungsverfahren von P zählten 1.) der Zusatz von unterschiedlichen Mengen Wasser zu P, 2.) die Behandlung mit Aktivkohle während eines Filtrationsprozesses, wobei das Massenverhältnis Adsorbens : Filtrat bei etwa 1 : 5000 lag, 3.) die Variation des pH-Wertes zwischen pH 1 und 10 durch Zusatz von ethanolischen Laugen bzw. Säuren, die Anwendung von 4.) Unterdruck, 5.) Spülgasen wie Argon oder 6.) von Ultraschall, 7.) die Variation der Lagerdauer in Tanks mit einem Volumen von mehreren tausend Litern bzw. in Glasflaschen mit Nennfüllmengen von 200 – 1000 ml von Stunden bis mehreren Wochen, 8.) die Variation der Lagertemperatur von Raumtemperatur (ca. 20 °C) bis zur Tiefkühlung bei - 21 °C sowie 9.) die Filtration über Metallkatalysatoren bei Massenverhältnissen Adsorbens : Filtrat von etwa 1 : 1000 (vgl. hierzu Kapitel 7., S. 135). Um den Einfluss von Unterdruck auf die makro-olfaktorischen Merkmale von P zu überprüfen, wurden 100 ml einer jungen, unangenehm riechenden Probe in einen 250 ml Rundkolben bei 600 hPa bei Raumtemperatur an einem Rotationsverdampfer bei 120 rpm 5 Minuten lang evakuiert und anschließend mit der Ausgangslösung geruchlich verglichen. Der Einfluss von Spülgas wurde ebenfalls an 100 ml unfiltrierter Probe getestet, die in einer 250 ml Gaswaschflasche 5 Minuten mit Argon unter gleichzei- - 48 - Experimenteller Teil: Verfahren zur Beeinflussung des Fehleindrucks tigem Rühren mit einem Magnetrührer durchspült wurde. Der Gasdurchsatz betrug etwa 1 l/min. Die Wirkung von Ultraschallwellen wurde an 100 ml unfiltrierter Probe getestet, die in einer 250 ml Gaswaschflasche 10 Minuten in einem Ultraschallbad (Sonorex RK106S, Firma Bandelin) behandelt wurden. Sowohl nach der Gasspülung als auch nach der Ultraschallbehandlung wurden der Geruch der behandelten Probe mit dem der Ausgangslösung verglichen. Der Vorteil der beschriebenen Verfahren lag darin, u.U. signifikante, olfaktorische Veränderungen innerhalb kürzester Zeit an einer Charge von P provozieren zu können, die einen Vergleich von Zuständen zuließen, ohne möglicherweise nicht auszuschließende Chargenunterschieden in der Zusammensetzung von vornherein mitberücksichtigen zu müssen. Anhand dieser Vergleiche war es möglich, das Verhalten olfaktorisch relevanter Verbindungen gezielt zu überprüfen und Bedingungen aufzustellen, deren Einhaltung die notwendigen Voraussetzungen für ihre tatsächliche Beteiligung am Fehleindruck bzw. den zu untersuchenden Aromaververänderungen von P bilden. Die Ergebnisse der olfaktorischen Beurteilungen der Verfahren finden sich im Kapitel 5.1 ab S. 64, die der instrumentellen Analyse in den Kapitel 5.4.2 bis 5.4.6 ab S. 96. - 49 - Experimenteller Teil: Sensorische Untersuchungsmethoden 4.2 Methoden Die zur Klärung des gestellten Problems angewendeten Verfahren werden im Folgenden getrennt nach sensorischen und instrumentellen Methoden beschrieben. Wesentliche Analysenparameter sind in tabellarischer Form am Ende des betreffenden Verfahrens zusammengefasst aufgeführt. 4.2.1 Sensorische Untersuchungsmethoden Um die geruchlichen Veränderungen an P mit mikro-olfaktorischen und instrumentell-analytischen Daten vergleichen zu können, wurden zunächst unterschiedliche makro-olfaktorische Zustände definiert und festgelegt. Ermittelt wurden diese Zustände von P in Verkostungen durch Vergleich der olfaktorischen Merkmale von unbehandelten Proben mit denen, die aus unterschiedlichen Verfahren zur Beeinflussung des Fehleindrucks an P resultierten (vgl. Kapitel 4.1.3, S. 48). 4.2.1.1 Verkostungen Die Veränderung der sensorischen Merkmale des Untersuchungsmusters während der Lagerzeit wurden routinemäßig im Trio-Vergleichstest (Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG 00.90.7) in speziellen Verkostungsgläsern (nach DIN 10 956) von jeweils vier Verkostern ermittelt und protokolliert. Verglichen wurden dabei der Geruch der originären sowie einer 1 : 3 mit Wasser verdünnten Probe. Das Füllvolumen bei den Geruchsuntersuchungen betrug 30 ml. An den verdünnten Mustern wurden auch geschmackliche Merkmale verglichen. Als Verkostungsstandards wurden zwei ältere, als Standards zugelassene und freigegebene Produktionschargen verwendet. Bei der Untersuchung des Einflusses verschiedener Maßnahmen auf das Geruchsphänomen wurden die makro-olfaktorischen Merkmale auf ähnliche Weise ermittelt. Im Unterschied zu den Routineverkostungen wurden bei den Überprüfungen der chemischen wie physikalischen Beeinflussungen des Untersuchungsmaterials die behandelten mit den nicht behandelten Proben verglichen. Verkostungsstandards, wie sie in den Dreiecksprüfungen verwendet wurden, wurden dabei nicht herangezogen. - 50 - Abb. 4-4: Verkostungsglas nach DIN 10956 Experimenteller Teil: Sensorische Untersuchungsmethoden 4.2.1.2 Profilanalyse und Rangordnungsprüfung Die Schwierigkeit, eine verbale Beschreibung des zu untersuchenden Geruchsphänomens zu geben, trat bereits frühzeitig auf. Schon die verbale Beschreibung des würzigen, produkttypischen Geruchs erwies sich als schwierig. Bei den Routineverkostungen waren zur Charakterisierung des Geruchs der originären Probe die vier Deskriptoren "krautig", "mild", "abgerundet" und "muffig" gewählt worden (vgl. Protokoll in Anhang I A, S. 146). Diese Deskriptoren hätten jedoch bei einer Profilanalyse des produkttypischen Geruchs nur schwer ungeschulten Prüfern vermittelt werden können, da definierte Vergleichsstandards kaum zu finden gewesen wären (vgl. LAWLESS und HEYMANN, 1998, S. 341 ff.; WIDDER, 1998, S. 102). Andere Deskriptoren für den Fehlgeruch, um im Zuge einer Profilanalyse möglicherweise detailliertere sensorische Informationen mit instrumentellanalytischen Daten vergleichen zu können, wurden nicht festgelegt: Die Zustände des Untersuchungsmaterials "mit Fehleindruck" und "ohne Fehleindruck" waren derart ausgeprägt und typisch, wenn auch schwer beschreibbar, dass eine Profilanalyse oder auch ein „Free choice Profiling“ (vgl. LAWLESS und HEYMANN, 1998, S. 368) zur Klärung der Fragestellung als nicht notwendig erachtet wurde. Die geruchlichen Auswirkungen von pH-Wert-Änderungen wurden dagegen in einem Rangfolge-Test nach KRAMER (1974, S. 121-133) analog dem amtlichen Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG „Rangordnungsprüfung“ (L 00.90.4) ermittelt. Hierbei wurden gleichzeitig die Unterschiede zwischen verschieden lang gelagerten Mustern von P beurteilt, indem zwei Proben relativ junger, schlecht riechender Chargen sowie eine Charge einwandfreier sensorischer Qualität mit 10%iger ethanolischer NaOH-Lösung beziehungsweise 10%iger ethanolischer Schwefelsäure auf pH 10 bzw. auf pH 1 eingestellt und jeweils zusammen mit der unbehandelten Ausgangslösung einem Geruchstest unterzogen wurden. Die vier Tester sollten den Geruch der neun Proben jeweils in pH- bzw. Altersgruppen geordnet untereinander vergleichen und Noten zwischen 1 bis 3 verteilen, wobei 1 die beste und 3 die schlechteste geruchliche Qualität darstellte (vgl. Verkostungsprotokoll, Anhang I C, S. 149). Doppelbenotungen waren zugelassen. Ergebnisse sind in Kapitel 5.1.3, S. 65, einzusehen. 4.2.2 Gaschromatographie-Olfaktometrie (GCO) Um die mikro-olfaktorischen Merkmale verschiedener Zustände von P zu studieren, wurde zur Durchführung der GCO ein konventioneller Gaschromatograph mit einem „Sniffing-Port“ ausgerüstet. - 51 - Experimenteller Teil: Sensorische Untersuchungsmethoden 4.2.2.1 Sniffing-Port Als „Sniffing-Port“ wird eine Vorrichtung bezeichnet, die eine gaschromatographische Trennsäule aus dem GC-Ofenraum herausführt und die von der GCSäule eluierten Substanzen der Detektion durch die menschliche Nase zuführt. Zur nachträglichen Ausrüstung eines Gaschromatographen empfiehlt sich, eine individuell auf das vorhandene System abgestimmte Lösung zu wählen. Im vorliegenden Fall wurde dabei eine GC-Kapillare durch ein 30 cm langes Schwanenhalsstück so variabel aus dem GC-Ofen geführt, dass der Proband die Position des "Sniffing-Ports" für seine Belange einstellen konnte. Die Fixierung des Schwanenhalsstückes erfolgte in einem beheizbaren GC-Body, einem vorinstallierten Ofenwand-Durchlass optionaler Detektoren oder Injektoren. Abb. 4-5: Aufbau eines SniffingPorts (Längsschnitt) Da die Heizleistung des GC-Ofens und des GC-Bodys üblicherweise nicht ausreicht, um genügend hohe Trägergastemperaturen bis ans Ende der Transferleitung zu garantieren, muss diese Strecke zur Verhinderung von Kondensationen zusätzlich beheizt werden. Weil an die GC-Ofentemperatur gekoppelte temperaturgesteuerte Einheiten technisch nur aufwendig zu realisieren und daher im Allgemeinen recht teuer sind, wurde während des GCLaufes bei gleichbleibender Transferleitungstemperatur gearbeitet. Um Kontaminationen der Transferkapillare weitgehend zu verhindern, wurde aufgrund der fehlenden Ausheizphase die Transferleitung mit einer unbelegten desaktivierten Transferkapillare bestückt. Die Temperatur der Transferleitung sollte über der Elutionstemperatur des am schwersten flüchtigen Analyten liegen. Zu hohe Temperaturen können allerdings die Durchflussraten des Trägergases herabsetzen. Wird der Trägergasstrom der Trennkapillare wie in den meisten - 52 - Experimenteller Teil: Sensorische Untersuchungsmethoden Fällen üblich zwecks destruktiver Paralleldetektion (z.B. über einen FID) mit einem Y-förmigen Glas-Seal-Verbinder geteilt, muss davon ausgegangen werden, dass die Temperierung der Transferleitung Einfluss auf die Gasstromteilung ausübt und Empfindlichkeitsverschiebungen zur Folge haben kann. Um die synchrone Detektion an beiden Detektorsystemen zu gewährleisten, ist zudem zwischen dem Y-förmigen Säulen-Splitter und dem FID eine ebenso lange Transferkapillare, aus demselben unbelegten, desaktivierten Material wie die zum Sniffing-Port gefertigte, zu wählen. Die Temperierung kann mit einer Heizschnur (Heizschnur Tmax. 400 °C, z.B. Firma C. ROTH, Art-Nr.: C999.1), die Regulierung mit einem kommerziellen Leistungssteller (z.B. Firma C. ROTH, Art-Nr.: E047.1) und einem Temperaturfühler (Thermoelement, z.B. Firma C. ROTH, Art-Nr.: E048.1) realisiert werden. Zur Befestigung der Heizschnur empfiehlt sich Glasgewebeband, zur Wärmeisolierung der Einheit Aluminiumfolie. Alle, bei höheren Temperaturen nicht geruchsneutralen Werkstoffe wie z.B. beschichtete Metallteile oder Isoliermaterialen sind zu vermeiden bzw. im Voraus bis zu einem geruchsneutralen Zustand auszuheizen. Der Temperaturfühler zur Regulierung und Steuerung der Heizleistung sollte etwa auf der Hälfte der Strecke des Schwanenhalsstückes platziert werden. Die Transferkapillare wurde in einem dünnen, biegsamen Innenrohr aus Kupfer durch das Schwanenhalsstück geführt. Der Kupferkapillare kamen mehrere Funktionen zu: 1. Sie führte die Transferkapillare und schützte sie vor dem Temperaturfühler, 2. erhöhte die Steifheit und Stabilität der Schwanenhals-Transferleitung, die bei hohen Temperaturen abnahm, 3. hielt die Stahlkapillare und trug damit den Nasenadapter des Sniffing-Ports und 4. verbesserte die Temperierung der Transferkapillare, indem sie ca. 10 cm in den GC-Ofen hineinreichte und die programmgesteuerte Ofentemperatur verzögert annahm. Der Nasenadapter des Sniffing-Ports besaß drei Eigenschaften: 1. Er hatte einen zweiten Anschluss für die Zuleitung befeuchteter Luft, 2. entsprach weitgehend der Anatomie der menschlichen Nasenregion und 3. ließ sich an eingeschmolzenen Haken mit Haltefedern sicher an der Transferleitung fixieren. Ein solcher Adapter kann z.B. von einem Glasbläser nach individuellen Angaben gefertigt werden. - 53 - Experimenteller Teil: Sensorische Untersuchungsmethoden Für die Bereitstellung befeuchteter Luft, die beim "Abriechen" zur Verhinderung des Austrocknens der Nasenschleimhäute unerlässlich ist, werden eine Gasversorgung mit Druckluft inklusive eines Feinregelventils, eine Waschflasche und entsprechende geruchsneutrale Verbindungsschläuche (z. B. aus PTFE) benötigt. 4.2.2.2 Trennsäulen in der GCO Die Analytik von leichtest flüchtigen Verbindungen stellt hohe Anforderungen an die Retentionskraft und die Trennleistung von GC-Säulen. Kapillarsäulen zeichnen sich gemeinhin durch hohe Trennleistungen aus. Für Sniffing-Analysen bewährten sich Kapillarsäulen mit einem Innendurchmesser von 0,32 mm (Medium-Bore-Kapillaren). In Säulen dieses Durchmessers konnten zeitweise sogar bis zu 2 µl der Probe splitlos über einen Split/Splitless-Injektor (SSI) injiziert und am Sniffing-Port abgerochen werden, ohne dass die Säulen beschädigt wurden. Voraussetzung hierfür war allerdings die kovalente Bindung der stationären Phase. Da die Trennleistung der Säule mit steigendem Innendurchmesser abnimmt, ist die Säulenlänge so groß wie möglich zu wählen, um die für die Applikation, gerade für leichtest flüchtige Stoffe, notwendige Trennstufenzahl zu gewährleisten. Bei den MS-Messungen musste überdies die „Verkürzung“ der Säule durch das in die Kapillare reichende Vakuum der Ionenquelle berücksichtigt werden. Bei den verwendeten Medium-Bore-Kapillaren wurde die Säulenlänge während der MS-Messungen dadurch um fast die Hälfte ihrer Länge „verkürzt“. Die Retentionskraft einer Kapillare wird vor allem durch das Kapazitätsverhältnis ß charakterisiert. Für leichtest flüchtige Verbindungen müssen daher die Filmdicken der Säule mindestens 1 µm betragen, um eine Trennung von Gasmolekülen im Bereich des Luftpeaks ansatzweise erzielen zu können. Zur Trennung von Aromastoffen, inklusive ätherischer Öle, empfehlen sich gebundene Polyethylenglycolphasen. Bei allen GCO-Untersuchungen wurde daher z.B. eine 50 m lange DB-Wax®-Säule (0,32 mm ID, 1 µm FD) verwendet. 4.2.2.3 Anwendung des Sniffing-Ports Die Atemtechnik, die beim Abriechen eines Aromagramms entwickelt wird, ist sicher individuell verschieden. Bei langen GC-Läufen muss allerdings vorrangig sichergestellt werden, dass ruhig und regelmäßig durch die Nase ein- und ausgeatmet werden kann. Beim Einatmen wurde die Nase ca. 3 s lang in den Adapter gehalten und Gerüche registriert, anschließend wurde sie leicht herausgezogen und ca. 1 s lang am Rand des Adapters vorbei durch die Nase - 54 - Experimenteller Teil: Sensorische Untersuchungsmethoden ausgeatmet. Die Tatsache, dass etwa ein Viertel eines Aromagramms bei jedem Lauf aufgrund des Ausatmens nicht registriert werden kann, zwingt zu Wiederholungsläufen. Die mikro-olfaktorischen Merkmale eines Zustandes von P wurden daher bei der GCO mindestens dreimal pro Probe abgerochen. Die Retentionszeit von Geruchsassoziationen wurde mit einer Stoppuhr bestimmt, mit der bis zu zehn Zwischenzeiten während eines GC-Laufes aufgenommen und anschließend abgerufen werden konnten. Eine solche Uhr gestattete es, ohne Beeinflussung von außen, z.B. durch die Anwesenheit von protokollierenden Personen, allein durch Drücken des Zwischenzeitenknopfes in Wiederholungsläufen mit befriedigender Objektivität die Detektion eines olfaktorischen Reizes zeitlich festhalten und somit bestimmen zu können. Die folgende Tabelle enthält alle Informationen zu den untersuchten Proben, den Analysenparametern und Geräteeinstellungen der beiden meistbenutzten Aufgabentechniken sowie der Detektoreinstellungen. Analysenparameter GCO Proben unbehandelte und behandelte Proben, Destillate dieser Proben Behandlungen: Filtration über Aktivkohle, destillative Anreicherungen von P, unterschiedlich lange Lagerzeiten. GC Typ HRGC8060 Fisons Säule DB-Wax , 50 m 0,32 mm ID, 1 µm FD Temperaturprogramm 4 min isotherm bei 40 °C, Heizrate: 6 °C/min, 6 min isotherm bei 250 °C ® Aufgabesystem 1 Headspace-Autosampler HS 40 (Perkin Elmer) HS/GCO Injektion automatisch (Gleichdruckdosierung) Kopplung direkt mittels desaktiviertem Universal Press-Fit, GC-Injektor: überbrückt Trägergas vom HS 40 Helium 4.6 Trägergasdruck am HS 40 75 kPa lin. Trägergasgeschwindigkeit ca. 30 cm/s Probenkonditionierung 20 min bei 65 °C Probenvolumen 8 ml/22 ml Nadel-/Transfertemperatur 100 °C/120 °C Injektortemperatur 120 °C Aufgabesystem 2 Injektor SSI (Fisons) GCO flüssig: automatisch, AS 800 (Fisons) Injektion gasförmig: manuell, gasdichte Spritze (Hamilton) Injektortemperatur 180 bis 220 °C Injektionsvolumen 1- 2 µl (flüssig), 100 - 300 µl (Headspace) Split 5 s geschlossen, dann 40 : 15 ml/min Trägergas GC Helium 4.6 Trägergasdruck 60 kPa lin. Trägergasgeschwindigkeit ca. 32 cm/s (Fortsetzung nächste Seite) - 55 - Experimenteller Teil: Sensorische Untersuchungsmethoden Säulen-Splitting ja desaktivierter Y-förmiger Glas-Sealverbinder Detektor 1 Sniffing-Port Transferleitung: 180 °C Hilfsgas befeuchtete Luft 5 ml/min Detektor 2 FID 220°C Hilfsgase Wasserstoff 30 kPa synthetische Luft 90 kPa Stopp-Uhr, Integrator Shimadzu C-R6A Chromatotec Auswertung 4.2.3 Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) Die Aromaextraktverdünnungsanalyse wurde analog dem Verfahren der GCOUntersuchungen durchgeführt. Allerdings wurden hierbei nur Flüssiginjektionen von originären Produktionschargen von P unterschiedlichen Alters bzw. deren Verdünnungen untersucht. Die Verdünnung der Untersuchungsmuster erfolgte mit einem genau auf die Dichte von P eingestellten Ethanol/Wassergemisch. Die Analysenparameter sind in der folgenden Übersicht tabellarisch aufgeführt: Analysenparameter AEVA Proben unbehandelte und behandelte Behandlungen: Verdünnungen, Filtration Proben; unfiltrierte, junge über Aktivkohle, unterschiedlich lange Proben gegen filtrierte, alte Lagerzeiten GC Typ HRGC8060 Fisons Säule Säule: DB-Wax , 50 m 0,32 mm ID, 1 µm FD Temperaturprogramm 4 min isotherm bei 40 °C, Heizrate: 6 °C/min, 6 min isotherm bei 250 °C ® Aufgabesystem Injektor SSI (Fisons) Injektion flüssig: automatisch, AS 800(Fisons) Injektortemperatur 200 °C Injektionsvolumen 1 – 2 µl Split 5 s geschlossen, 40 : 15 ml/min Trägergas Helium 4.6 Trägergasdruck 60 kPa lin. Trägergasgeschwindigkeit ca. 32 cm/s (Fortsetzung nächste Seite) - 56 - Experimenteller Teil: Sensorische Untersuchungsmethoden Säulen-Splitting nein (aber fakultativ möglich) desaktivierter Y-förmiger Glas-Sealverbinder Detektor 1 Sniffing-Port Transferleitung: 180 °C Hilfsgas befeuchtete Luft 15 ml/min Detektor 2 (fakultativ) FID 220 °C Hilfsgase Wasserstoff 30 kPa synthetische Luft 90 kPa Auswertung 4.2.4 Stopp-Uhr, Integrator (fakulta- C-R6A Shimadzu Chromatotec tiv) Geruchsschwellenwertermittlung Der Geruchsschwellenwert von mikro-olfaktorisch aktiven Verbindungen in der Untersuchungsmatrix stellt ein wesentliches Kriterium für den tatsächlichen Anteil des Betrags des Geruchsstoffes am Gesamtaroma dar (vgl. Kapitel 3.6.4, S. 41). Die Ermittlung erfolgte ähnlich wie die Geruchsprüfungen bei den Verkostungen. Hierbei wurden Verkostungsgläser mit kontinuierlich geringer werdenden Verdünnungen einer olfaktorisch relevanten Substanz in sensorisch einwandfreiem Untersuchungsmaterial (Matrixcharge) befüllt. Das Füllvolumen der Gläser war dabei innerhalb der Reihe konstant zu halten, üblicherweise wurden 30,0 ml eingesetzt. Die Probanden mussten nacheinander die Reihe der Verkostungsgläser in Richtung steigender Konzentrationen abriechen und dabei angeben, bei welchem Glas eine geruchliche Änderung wahrgenommen wurde und bei welchem Glas diese Veränderungen beschrieben werden konnten. Dabei durfte jeweils nur einmal an einem Verkostungsstandard gerochen werden. Die Ergebnisse wurden in einem Verkostungsprotokoll nach Anhang I B (S. 148) festgehalten. - 57 - Experimenteller Teil: Instrumentelle Untersuchungsmethoden 4.2.5 Instrumentelle Untersuchungsmethoden 4.2.5.1 Hochauflösende Gaschromatographie/Massenspektrometrie (HRGC/MS) Die HRGC/MS-Kopplung stellt eine potente Kombinationstechnik für die Analytik von Vielstoffgemischen dar. Dabei liefert die massenselektive Registrierung analytenspezifischer Fragmentierungsprozesse wertvolle Hinweise zur Identifizierung von unbekannten, gaschromatographisch vorgetrennten Verbindungen. Die Untersuchungen wurden mit einem HRGC 8060 (Fisons) und einem Quadrupol-Massenspektrometer Modell TRIO 1000 (Fisons) im EI+Ionisationsmodus durchgeführt. Die negativ-chemische Ionisation (NCI) mit Ammoniak war zu selektiv und überdies zu unempfindlich für ScreeningUntersuchungen, so dass eine andere Ionisierungsart als EI+ keine Rolle bei den MS-Untersuchungen spielen sollte. Als analytische Trennsäulen für die leichtest flüchtigen Komponenten bewährten sich lange Medium-bore-Kapillarsäulen mit gebundenen Polyethylenglycolphasen (PEG) mit relativ dicken Filmen (50 m/60 m DB-WAX® bzw. DB-WAXetr®-Säulen, 0,32 mm ID, 1 µm FD), die schon bei der GCO eingesetzt wurden. Unpolare Säulen wie DB-5®- oder gar DB-1® Säulen waren bei weitem nicht so universell einsetzbar wie die PEG-Säulen. Daher wurde ausschließlich mit diesem Typ gearbeitet. Die Massenkalibrierung des Quadrupols erfolgte mittels Perfluortributylamin. Im Scan-Bereich bis über 200 Atommasseneinheiten (amus) wurde die Ionenquelle über die relative Ionenausbeute der vier Hauptmassen m/z 69, 264, 502 und 614 des Perfluortributylamins optimiert. Zur Identifizierung leichterer Fragmente, z. B. mit Massen unter 40 amus, hatte es sich als vorteilhaft erwiesen, die Ionenausbeute des Geräts auch nur auf den Bereich kleiner Massen z.B. mit m/z 31, 40, 69 und 100 ebenfalls unter Verwendung des Perfluortributylamins zu optimieren. - 58 - Experimenteller Teil: Instrumentelle Untersuchungsmethoden Die Analysenparameter sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: Analysenparameter HRGC/MS Proben unbehandelte und behandelte Proben, Destillate dieser Proben, Destillate von Drogen, Destillationsfraktionen Behandlungen: Filtration über Aktivkohle und Kupfer, destillative Anreicherungen von P, unterschiedlich lange Lagerzeiten und –temperaturen GC Typ HRGC8060 Fisons Säulen DB-Wax , 50 m 0,32 mm ID, 1 µm FD ® DB-Waxetr , 60 m 0,32 mm ID, 1 µm ® FD, DB-Waxetr , 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µm FD, DB-5, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µm FD Temperaturprogramm 4 min isotherm bei 40 °C, Heizrate: 3 °C/min, 10 min isotherm bei 250 °C Injektor SSI (Fisons) Injektion flüssig: automatisch, AS 800 (Fisons) oder SPME Injektortemperatur 220 °C Injektionsvolumen 1 µl Split 2-3 : 1, 30-45 : 15 ml/min Trägergas Helium 4.6 Trägergasdruck 30 - 50 kPa Aufgabesystem ® lin. Trägergasgeschwindigkeit ca. 30-35 cm/s Detektor MS TRIO 1000 (Fisons) Empfindlichkeit 450 EI + 70 eV, 240 °C Ionenenergie 1 kV (Beschleunigungsspannung) Quellendruck ca. 3 10 hPa Scan TIC, max. 29-250 amu; 0,8 s, SIR: 33, 34, 47, 48, 62. Tuning / Kalibrierung Perfluortributylamin 69, 264, 502, 614 (TIC) Auswertung Personal-Computer Quelle . -5 31, 40, 69, 100 (SIR) MASSLAB Ver. 1.33 4.2.5.2 Hochauflösende Gaschromatographie/hochauflösende Massenspektrometrie (HRGC/HRMS) Die Kopplung hochauflösender Kapillarsäulengaschromatographie (HRGC) mit hochauflösender Sektorfeld-Massenspektrometrie (HRMS) ist weniger für Screening-Untersuchung als vielmehr zum gezielten Nachweis charakteristischer Ionenspuren geeignet (vgl. PEPPARD, 1988, S. 242), denn die enorme Massenauflösung bei Sektorfeld-Geräten hat im Vergleich zu Quadrupolinstrumenten relativ geringe Transmissionsraten zur Folge. Die dadurch be- - 59 - Experimenteller Teil: Instrumentelle Untersuchungsmethoden dingten Empfindlichkeitseinbußen können nur durch die gezielte Registrierung von einzelnen Ionenspuren kompensiert werden (Single-Ion-Monitoring, SIM). Das Auflösungsvermögen A einer massenselektierenden Einheit wird als Quotient aus der Masse m des zu untersuchenden Ions und der Massendifferenz ∆m zur nächsten, abzutrennenden Nachbarmasse definiert: A= m ∆m (Gl. 10) Für die Messungen wurde ein Kapillargaschromatograph mit einem doppelfokussierenden Massenspektrometer mit NIER-JOHNSON-Geometrie gekoppelt. Die Analysenparameter sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: Analysenparameter HRGC/HRMS Proben unbehandelte und behandelte Proben, Destillate von Proben und Drogen Behandlungen: Filtration über Aktivkohle, Kupfer, destillative Anreicherungen von P GC Typ GC 3700 VARIAN Säule Säule: DB-Waxetr , 60 m 0,32 mm ID, 1 µm FD Temperaturprogramm 2 min isotherm bei 40 °C, Heizrate: 3 °C/min, 10 min isotherm bei 250 °C Injektor PAS1 (Gerstel) Injektortemperatur 200 °C Injektionsvolumen 1 µl (flüssig), 300 µl (Headspace) Split 3:1 Trägergas Helium 5.0 Trägergasdruck 50 kPa, 10,2 psi lin. Trägergasgeschwindigkeit ca. 35 cm/s Detektor MS VG 7070 70 cm Radius, SEV off-axis, EB-Konfiguration (VG Micromass) EB-Konfiguration Quelle EI + 70 eV, 240 °C Ionenenergie 4 kV (Beschleunigungsspannung) Scan 20 – 60, 5 s/decade Auflösung 5500 – 6000 Stickstoff 28,00615 Sauerstoff 31,98984 Argon 39,96238 Personal-Computer VG 7070 Aufgabesystem Kalibrierung Auswertung ® - 60 - Experimenteller Teil: Instrumentelle Untersuchungsmethoden 4.2.5.3 Headspace-Gaschromatographie (HS/HRGC) Bei der Untersuchung von Aroma- bzw. von Geruchsstoffen sind Aussagen zur stofflichen Zusammensetzung der Gasphase über dem Untersuchungsmaterial oft wesentlicher als Aussagen zur Probe selbst (WITTKOWSKI, 1987, S. 93). Die geeignete Technik zur Untersuchung von Gasphasen ist die Dampfraum- oder Headspace-Gaschromatographie (HS/HRGC). Grundlage dieser Technik ist das Verteilungsgleichgewicht von flüchtigen Stoffen zwischen einer Gasphase und, im vorliegenden Fall, flüssigen Probe in einem geschlossenen Gefäß bei konstanter Temperatur. Dabei kommt es zu einer relativen Anreicherung leichtflüchtiger Substanzen im Verhältnis zu schwerer flüchtigeren Probenbestandteilen (vgl. auch Kapitel 3.2.1, S. 23). Bei der statischen Headspace-Analyse wird bei konstanter Temperatur die Gleichgewichtseinstellung zwischen Probe und der sie umgebenden Gasphase abgewartet. Aus der Gasphase wird dann ein Aliquot entnommen und gaschromatographisch analysiert. Die Entnahme kann durch eine gasdichte Spritze, eine Probenschleife oder nach dem Prinzip der Gleichdruckdosierung erfolgen. Im Unterschied zur statischen Headspace-Analyse werden bei der dynamischen Arbeitsweise nicht nur einmal ein Aliquot, sondern mehrfach bzw. kontinuierlich größere Gasraumvolumina aus dem Probengefäß abgeleitet und entweder in Kühlfallen (vgl. Kapitel 4.1.2.3, S. 45) oder durch Festphasenadsorption (vgl. Kapitel 3.6.2, S. 38) konzentriert. Für die laufenden, automatisierten Headspace-Untersuchungen wurde der Dampfraum-Injektor HS 40 der Firma PERKIN-ELMER verwendet, der nach dem Prinzip der Gleichdruckdosierung arbeitet. Bei der statischen Injektionstechnik der Gleichdruckdosierung wird der nach der Druckaufbauphase (engl. Pressurization) aufgrund der erhöhten Temperatur und des Trägergasdrucks (Säulenvordruck, V1) im Probengefäß sich aufbauende Druck dazu benutzt, ein Gasraumaliquot aufgrund des Druckgefälles zur gaschromatograpischen Säule hin zu injizieren (vgl. Abb. 4-6). - 61 - Experimenteller Teil: Instrumentelle Untersuchungsmethoden Abb. 4-6: Ablauf der Gleichdruckdosierung in der statischen HS-Analyse. Aus: Perkin-ElmerManual HS 40 Während der Injektionsphase (Sampling) wird der Trägergasstrom mit Hilfe der Magnetventile V1 und V2 für eine festgelegte Zeit (Injektionszeit) abgestellt, wodurch ein Aliquot des Gasraums aufgrund des Probenflaschenüberdrucks in die gaschromatograpische Säule entweicht, bis sich der Druck ausgeglichen hat oder der Trägergasstrom wieder angestellt wird. Die injizierbare Probenmenge hängt dabei also lediglich vom erzielten Druckgefälle während der Injektionszeit und von deren Dauer ab. Da die Injektionszeit ohne Kryofokussierung wegen der verschlechterten Peaktrennung aufgrund der langen Probenaufgabe nicht beliebig lang gewählt werden kann, ist vor allem auf das zu erzielende Druckgefälle zu optimieren. Trotzdem wurde auch eine direkte Kopplung der Transferkapillare mit der Trennkapillare ohne Drucksenke mit der theoretisch vorteilhafteren SplitKopplung verglichen. Die Parameter der verschiedenen, angewandten HS-Aufgabetechniken sind in folgender Übersicht zusammengefasst: - 62 - Experimenteller Teil: Instrumentelle Untersuchungsmethoden Analysenparameter statische HS-Untersuchungen Proben unbehandelte und behandelte Proben, Destillate dieser Proben, Destillate von Drogen, Drogen Behandlungen: Filtration über Aktivkohle, Kupfer, Eisen und Zink, destillative Anreicherungen von P und den eingesetzten Drogen, unterschiedliche Lagerzeiten, -temperaturen und pH-Werte, Wasser- und Aminosäurezusätze Aufgabesystem 1 manuell Gerät ® Mikroliterspritze, Serie 1000 Hamilton Trägergas vom GC Helium Trägergasdruck GC 50 kPa Säule DB-Waxetr , 60 m 0,32 mm ID, 1 µm FD SSI Temperatur: 180 °C (Fisons) Injektionsvolumen max. 300 µl Split Injektor gasdichte Spritze geschlossen ® Aufgabesystem 2 automatisch Gerät Headspace-Autosampler HS 40 (Perkin Elmer) Kopplung direkt Verbinder: GRAPHPACK-Säulenverbinder 3D/2, Universal Press-Fit oder GlasSeal-Verbinder, desaktiviert. Probenkonditionierung 20 min bei 65 °C Probenvolumen 8 ml/22 ml bzw. 6 g/22 ml Nadel-/Transfertemperatur 100 °C/120 °C Injektionsdauer 0,12 min Trägergas vom HS Helium Trägergasdruck GC 0 kPa HS 40 75 kPa Säule DB-Waxetr , 60 m 0,32 mm ID, 1 µm FD SSI: überbrückt Temperatur: 120 °C (Fisons) Split geschlossen Injektor ® Aufgabesystem 3 automatisch Gerät Headspace-Autosampler Kopplung HS 40 (Perkin Elmer) indirekt Probenkonditionierung Probenvolumen 8 ml/22 ml bzw. 6 g/22 ml Nadel-/Transfertemperatur 100 °C/120 °C Injektionsdauer 0,12 min Trägergas vom HS bzw. GC (optional) Helium Trägergasdruck GC 50 kPa HS 40 bis zu 100 kPa Säule DB-Waxetr , 60 m 0,32 mm ID, 1 µm FD SSI Temperatur: 120 °C (Fisons) Split Injektor 20 min bei 65 °C offen, stellt Druckdifferenz zwischen HS 40 und GC (Optimum: 50 kPa) her ® Der HS 40 wurde als Aufgabesystem sowohl bei der HS/GCO als auch bei der HS/HRGC/MS eingesetzt. - 63 - Ergebnisse: Makro-olfaktorische Zustände von P 5. Ergebnisse Da die Erzeugung, Beschreibung und Klassifizierung unterschiedlicher, makro-olfaktorischer Geruchszustände von P (vgl. Kapitel 5.1.8, S. 70) die Grundlage für alle sich anschließenden mikro-olfaktorischen wie instrumentellanalytischen Untersuchungen bildete, werden zunächst die Ergebnisse der unterschiedlichen Einflussverfahren auf den Fehleindruck aufgeführt. Nach der Darstellung der Erfahrungen mit unterschiedlichen Aromaanreicherungstechniken (Kapitel 5.2, S. 72) und der Ergebnisse der mikro-olfaktorischen Verfahren GCO, HS/GCO und AEVA (Kapitel 5.3, S. 85) wird die Zuordnung und Verknüpfung der sensorischen Daten mit instrumentell-analytischen erfolgen (Kapitel 5.4, S. 91). Die Verifizierung der Rolle einzelner, problemrelevant erscheinender Geruchsstoffe erfolgt ab Kapitel 5.4.2, S. 96. 5.1 Makro-olfaktorische Veränderungen des Fehlgeruchs durch äußere Einflüsse Hierbei werden die Einflüsse der Lagerdauer, der Filtration über Aktivkohle, von pH-Wert-Verschiebungen, Verdünnungen mit Wasser, Lagerung bei tiefen Temperaturen, Unterdruck, Gaswäsche und Ultraschallbehandlung (vgl. Kapitel 4.1.3, S. 48) auf wahrzunehmende geruchliche Veränderungen untersucht und beschrieben. 5.1.1 Veränderungen durch Lagerzeit Das in der vorliegenden Arbeit vorrangig zu untersuchende Problem bestand in der Identifizierung der Vorgänge, die bei P während einer mehrere Wochen dauernden Reifeperiode von einem unangenehmen, muffigen Geruch zu einem angenehmen, würzigen Produktaroma führen. In einem Zeitraum von 12 Monaten wurden bei 59 Verkostungen, bei denen eine gelagerte Probe im Trio-Vergleichstest gegen zwei sensorisch einwandfreie, mehrere Monate gelagerte Standards verkostet wurde, der Geruch der Probencharge in nur 7 von insgesamt 236 abgegebenen Urteilen mit dem eines Standards verwechselt und damit nicht erkannt. Die Erkennungsrate des produktuntypischen, unangenehmen Anfangsgeruchs lag somit selbst bei bereits mehreren Wochen tankgelagerten Mustern noch bei über 97 %. Bereits in der Einleitung wurde erwähnt, dass erfahrene Verkoster in der Lage waren, Proben innerhalb der ersten 6 Wochen nach Produktion nur aufgrund ihres Geruchs der Produktionswoche zuzuordnen. Die geruchlichen Verbesserungen während der ersten Wochen der Lagerung wurden daher als stetig verlaufend angenommen (vgl. Kapitel 2.4, S. 17, Abb. 2-1). - 64 - Ergebnisse: Makro-olfaktorische Zustände von P Damit wird deutlich, wie stark sich das Aroma während der Lagerzeit wandelt. Die relative Rate der Verbesserungen scheint erst nach mehreren Wochen geringer zu werden, um schließlich das Niveau des produkttypischen Geruchs zu erreichen. Der Zeitraum, in dem dieses sensorische Niveau erreicht wird, beträgt etwa drei Monate bei Tanklagerung, drei Wochen bei Flaschenlagerung und etwa drei Stunden in einem Verkostungsglas. 5.1.2 Veränderungen durch Aktivkohle Im Verlauf der Untersuchungen wurden zahlreiche olfaktorische Vergleiche zwischen unfiltrierten, gerade hergestellten Proben und ihren über AktivkohleCellulose-Filterplatten filtrierten Varianten angestellt (vgl. Kapitel 4.1.3, S. 48). Wurden filtrierte und unfiltrierte Proben einer Charge miteinander verglichen, stieg die Erkennungsrate des unangenehmen Geruchs der unfiltrierten Variante auf 100 %. Ein maximaler olfaktorischer Unterschied an P war damit zunächst durch den Vergleich unfiltrierter, junger Chargen mit filtrierten, alten Chargen gegeben. 5.1.3 Veränderungen durch pH-Wert-Verschiebungen Ausgehend von den durch die vier Prüfer während des Rangfolge-Tests nach KRAMER vergebenen Noten (vgl. Kapitel 4.2.1.2., S. 51 und Anhang I C, S. 149) ließen sich folgende Rangsummen ermitteln. Die Ergebnisse der Benotung sowie die Zuordnung zu Rangwerten und die Auswertung der Rangsummen werden im Folgenden dargestellt. Vergleich der unterschiedlichen pH-Stufen: Prüfer 1 Beschreibung Prüfer 2 Nr. Note Nr. Note Nr. Note Beschreibung Nr. Note Nr. Note Nr. Note 31 2 32 3 33 3 21 1 22 1 23 1 1 12 3 13 3 pH = 10 31 2 32 1 33 1 pH = 10 pH = 6 21 1 22 2 23 2 pH = 6 pH = 1 11 1 12 3 13 3 pH = 1 11 Alter 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen filtriert unfiltriert unfiltriert Alter Zustand 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen Filtriert unfiltriert unfiltriert Prüfer 3 Zustand Prüfer 4 Beschreibung Nr. Note Nr. Note Nr. Note Beschreibung Nr. Note Nr. Note Nr. Note pH = 10 31 2 32 2 33 2 pH = 10 31 3 32 3 33 3 pH = 6 21 1 22 1 23 2 pH = 6 21 1 22 2 23 1 pH = 1 11 2 12 3 13 3 pH = 1 11 2 12 1 13 2 Alter 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen Alter 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen Filtriert unfiltriert unfiltriert filtriert unfiltriert unfiltriert Zustand - 65 - Zustand Ergebnisse: Makro-olfaktorische Zustände von P Rangsummen „pH-Wert“: Beschreibung Nr. Summe Nr. Summe Nr. Summe pH = 10 31 9 32 9 33 9 pH = 6 21 4 22 6 23 6 pH = 1 11 6 12 10 13 11 Alter Zustand 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen filtriert unfiltriert innerhalb des kritischen Rangsummenbereichs nach KRAMER unfiltriert Nach KRAMER liegen die kritischen Rangsummen bei der Untersuchung von neun Proben in vier Versuchsreihen (= Anzahl der Prüfer) und einem Signifikanzniveau α von 0,05 zwischen 8 und 32. Bei der Untersuchung des Einflusses des pH-Wertes auf den Geruch konnten damit folgende Zustände signifikant unterschieden werden: 1. Die Rangsummen der alkalisierten Proben liegen alle innerhalb des kritischen Rangsummenbereiches. Untereinander können an diesen Mustern keine signifikanten Unterschiede festgestellt werden. Die Proben riechen aber signifikant schlechter als die unbehandelten Varianten bzw. die angesäuerte, neun Monate gelagerte Probe. Allerdings hatte dieser als unangenehm empfundene, olfaktorische Eindruck weder etwas mit dem typischen noch mit dem zu untersuchenden, unangenehmen Geruch zu tun. Die starke Ablehnung muss durch einen völlig neuen, produktuntypischen Geruchseindruck bei pH 10 verstanden werden. Der Geruch wurde als „feucht“, „heuartig“ bis „fischig“ beschrieben. 2. Die relativ jungen, unfiltrierten Proben wiesen bei pH 1 einen signifikant schlechteren Geruchseindruck auf als das filtrierte, gelagerte Muster bzw. ihre nicht angesäuerten Varianten. 3. Das unbehandelte, neun Monate gelagerte Muster erzielte mit dem Wert 4 die kleinst mögliche Rangsumme überhaupt und wurde damit am meisten präferiert. Beim Vergleich der Altersstufen wurden folgende Rangwerte ermittel: - 66 - Ergebnisse: Makro-olfaktorische Zustände von P Vergleich der Altersstufen: Prüfer 1 Prüfer 2 Beschreibung Nr. Note Nr. Note Nr. Note pH = 10 31 2 32 2 33 pH = 6 21 1 22 2 pH = 1 11 1 12 2 Alter 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen Filtriert unfiltriert unfiltriert Zustand Beschreibung Nr. Note Nr. Note Nr. Note 2 pH = 10 31 1 32 3 33 3 23 2 pH = 6 21 1 22 1 23 2 13 2 pH = 1 11 1 12 3 13 3 Alter 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen filtriert unfiltriert unfiltriert Zustand Prüfer 3 Prüfer 4 Beschreibung Nr. Note Nr. Note Nr. Note pH = 10 31 3 32 1 33 pH = 6 21 1 22 2 pH = 1 11 1 12 2 Alter 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen Filtriert unfiltriert unfiltriert Zustand Beschreibung Nr. Note Nr. Note Nr. Note 2 pH = 10 31 2 32 2 33 3 23 3 pH = 6 21 1 22 2 23 2 13 3 pH = 1 11 1 12 2 13 3 Alter 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen filtriert unfiltriert unfiltriert Zustand Rangsummen „Lagerdauer“: Beschreibung Nr. Summe Nr. Summe Nr. Summe pH = 10 31 8 32 8 33 10 pH = 6 21 4 22 7 23 9 pH = 1 11 4 12 9 13 11 Alter Zustand 9 Monate 9 Wochen 8 Wochen filtriert unfiltriert innerhalb des kritischen Rangsummenbereichs nach KRAMER unfiltriert Bei der Untersuchung des Einflusses der Lagerdauer auf den Geruch zeigte sich ein ähnliches Bild wie zuvor: 1. Erneut wurde alle alkalisierten sowie die angesäuerten, unfiltrierten, jungen Varianten als schlechter riechend abgeleht. 2. Im direkten Vergleich der nicht behandelten Muster wird aber die 8 Wochen alten Probe bereits schlechter riechend als die eine Woche ältere Charge bewertet. Die olfaktorischen Vergleiche dieser Versuchsreihen bestätigten erneut die Beobachtung, dass die Lagerzeit zu einer Verbesserung des Geruchseindrucks an P führt. Zudem ließ sich der anfängliche Fehleindruck junger Proben durch Ansäuern verstärken (vgl. Kapitel 5.4.4, S. 100). Eine Alkalisierung von P führte dagegen zu einer vollständigen Charakteränderung des Geruchs von P. Die geringe Präferenz dieses Geruchseindrucks darf daher nicht überbewertet werden. - 67 - Ergebnisse: Makro-olfaktorische Zustände von P 5.1.4 Veränderungen durch Wasserzusatz Bereits kleine Verschiebungen des Wasseranteils in P führten zu einer Nivellierung der unangenehmen Geruchsmerkmale (vgl. Kapitel 2.4, S. 17, Abb. 2-2). Bei den Verkostungen, bei denen eine Verdünnung von P im Verhältnis 1 : 3 aufgrund des hohen Alkoholanteils erfolgen musste, waren Unterschiede, die mit den untypischen Geruchsmerkmalen in Verbindung hätten gebracht werden können, nicht mehr zu registrieren. Der Wasserzusatz führte zu einem angenehm würzigen, abgerundeten Geruchsprofil. 5.1.5 Einfluss tiefer Lagertemperaturen Während der Untersuchungen verbesserten sich die olfaktorischen Eindrücke an den in Glasflaschen abgefüllten Labormustern sehr viel schneller als an den tankgelagerten Produktionschargen. Eine Maßnahme, den Reifungsprozess an den Labormustern zu verlangsamen und den unangenehmen Geruchseindruck zu stabilisieren, wurde durch Lagerung der Labormuster bei -21 °C erreicht. Durch Tiefkühlung konnten die Veränderungen der olfaktorischen Merkmale entscheidend gehemmt werden. Beim Vergleich der im Wasserbad temperierten, zuvor tiefgekühlt gelagerten Proben mit den normal gelagerten Varianten wurden die bei Raumtemperatur gelagerten Muster eindeutig den zuvor tiefgekühlten vorgezogen. Bereits nach zwei bis vier Wochen waren die tiefgekühlten Varianten von denen bei Raumtemperatur gelagerten eindeutig zu unterscheiden, wobei der Geruch der tiefgekühlten Proben stets als schlechter empfunden wurde. Zudem fiel auf, dass an tiefgekühlten, nicht temperierten Proben der unangenehme Geruch stärker hervortrat als an Mustern bei Raumtemperatur, was erneut ein Indiz für eine offenbar hohe Flüchtigkeit potentieller Fehlgeruchssubstanzen darstellte. 5.1.6 Einflüsse von Unterdruck, Gaswäsche, Ultraschall Um eine hohe Flüchtigkeit des Fehlgeruchs zu bestätigen, mussten sowohl das Anlegen eines Unterdrucks, das Durchspülen der Probe mit Inertgas sowie die Einwirkung von Ultraschallwellen zu einer Verringerung der Wahrnehmbarkeit des Fehlgeruchs führen. Bei den Versuchen (vgl. Kapitel 4.1.3, Verfahren zur Beeinflussung des Fehleindrucks an P, S. 48), die bewusst auf eine schonende Behandlung von P abzielten, um bei einer möglichen, großtechnischen Realisierung einen möglichst geringen Einfluss auf andere Inhaltsstoffe von P auszuüben, ließ sich nur eine leichte Verringerung des als Fehlgeruch beschriebenen Phänomens - 68 - Ergebnisse: Makro-olfaktorische Zustände von P und Präferenz der behandelten Probe vor der unbehandelten feststellen. Da die erzielten Unterschiede geringer als erwartet waren, wurden derart behandelte Proben nicht für die mikro-olfaktorischen und instrumentell-analytischen Analysen eingesetzt. Die Intensivierung der oben beschriebenen Behandlungsverfahren wurde nicht angestrebt, da die Wirkung auf andere Produktinhaltsstoffe nicht absehbar war. 5.1.7 Sensorische Untersuchung von Destillationsfraktionen Wenn der anfängliche, unangenehme Geruchseindruck durch den Herstellungsprozess bedingt wäre und die geruchlichen Veränderungen nicht durch die Ausbildung eines als positiv empfundenen Aromas während der Reifeperiode verursacht werden würden, könnten in einigen Fraktionen des Destillats potentielle Fehlgeruchsstoffe in größeren Konzentrationen enthalten sein als im fertigen Endprodukt P. Bei der sensorischen Bewertung der Destillationsfraktionen wurden 14 Proben aus insgesamt 36 Fraktionen olfaktorisch beurteilt. Geordnet nach der Entnahmezeit wurden sie nacheinander abgerochen und ihr Geruch hinsichtlich des Auftretens des Fehlgeruchs bewertet. Als sensorische Vergleiche wurden die unfiltrierte und filtrierte Charge der Produktion, deren Fraktionen gesammelt worden waren, angeboten. Aus den Beschreibungen der 5 Verkoster ließ sich folgendes Geruchsprofil erstellen: 3,5 süßlicher Geruch Intensität eines unangenehmen Geruchs Abb. 5-1: Geruchliche Beurteilung von Destillationsfraktionen der Herstellung von P kohliger Geruch 3 unangenehmer Geruch 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 1100 Destillationszeit in Zeiteinheiten Aus dem Profil (Abb. 5-1) geht hervor, dass Fraktionen aus drei Destillationsphasen als unangenehm bewertet wurden. In der Anfangsphase der Destillation wurde ein kohliger, nach Dimethylsulfid riechender Geruch bemängelt, am Schluss der Destillation ein unangenehm süßlicher. Aber auch zur Halbzeit der Destillation wurde ein als "gammelig", "schlecht" und "kaffeeartig" beschriebener Geruch abgelehnt. - 69 - Ergebnisse: Makro-olfaktorische Zustände von P Der typische Geruch einer frisch produzierten Charge, unfiltriert oder filtriert, korrelierte dagegen mit keiner Fraktion. Daher wurde der sensorischen Beurteilung der atypisch riechenden Destillationsfraktionen keine überragende Bedeutung beigemessen. Eine Verringerung des unangenehmen olfaktorischen Phänomens von P über Änderung in der Destillationsprozessführung schien damit aber nicht möglich zu sein. 5.1.8 Zusammenfassung: Definition von makro-olfaktorischen Zuständen Alle unter Punkt 5.1 auf S. 64 ff. beschriebenen Verfahren hatten das Ziel, makro-olfaktorische Unterschiede an P zu erzeugen bzw. zu verstärken. Die Bewertung dieser Unterschiede führte nun erstmals zur Definition von zehn Geruchszuständen von P und zur Einschätzung, wie stark sich diese Geruchszustände voneinander unterschieden. Durch die Gegenüberstellung der Zustände „mit Fehleindruck“ und „ohne Fehleindruck“ wurden fünf makro-olfaktorische Zustandspaare festgelegt, zwischen denen mikro-olfaktorisch bzw. instrumentell-analytisch die stofflichen Veränderungen zu untersuchen waren. Dabei war bei der gezielten Suche nach aromarelevanten, stofflichen Unterschieden zu beachten, ob das Zustandekommen der diversen Geruchszustände möglicherweise durch die Verwendung verschiedener Drogenchargen mitbeeinflusst sein könnte oder nur durch eine mehr oder weniger bewusste Beeinflussung der stofflichen Zusammensetzung bei einer der beiden Zustände bedingt worden war. Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über die festgelegten Zustandspaare: Nr. Zustand „mit Fehleindruck“ Zustand „ohne Fehleindruck“ 1. unfiltriert, nicht gelagert filtriert, nicht gelagert 2. unfiltriert, nicht gelagert 3. unfiltriert, gelagert bei +20 °C im Dunkeln 4. unfiltriert, nicht gelagert, ohne Wasserzusatz 5. unfiltriert, nicht gelagert ohne Säurezusatz Besonderheiten des Vergleichs Chargenunterschiede: nein Zusammensetzung beeinflusst: ja Geruchsunterschied: mittel filtriert, gelagert Chargenunterschiede: ja Zusammensetzung beeinflusst: ja Geruchsunterschiede: groß unfiltriert, gelagert bei Chargenunterschiede: nein –21 °C im Dunkeln Zusammensetzung beeinflusst: nein Geruchsunterschiede: mittel unfiltriert, nicht gelaChargenunterschiede: nein gert, mit Wasserzusatz Zusammensetzung beeinflusst: ja Geruchsunterschiede: groß unfiltriert, nicht gelaChargenunterschiede: nein gert mit Säurezusatz Zusammensetzung beeinflusst: ja Geruchsunterschiede: mittel - 70 - Ergebnisse: Makro-olfaktorische Zustände von P Die Ergebnisse der mikro-olfaktorischen bzw. instrumentell-analytischen Vergleichsuntersuchungen müssen sowohl qualitativ als auch in ihrer Intensität mit den oben beschriebenen Zustandspaaren in Einklang gebracht werden können. Die instrumentell-analytische Untersuchung der zuvor olfaktorisch bewerteten Destillationsfraktionen wird zunächst vor allem vor dem Hintergrund einer möglichen Herstellungsprozessoptimierung und aufgrund des Konzentrierungseffektes der Fraktionierung nur begleitend durchgeführt. - 71 - Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren 5.1 Bewertung von Anreicherungsverfahren Die Untersuchung flüchtiger Verbindungen wie Aromastoffe stellt hohe Anforderungen an die Analytik. Dabei ist vor allem stets mit Verlusten bzw. Konzentrationsverschiebungen an Analyten während des analytischen Prozesses bis zur Detektion zu rechnen. Den Ergebnissen der instrumentellen Untersuchungen (vgl. Kapitel 5.4, S. 91) werden die Ergebnisse der Anreicherungsverfahren und die Optimierung der Headspace-Probenaufgabetechnik vorangestellt und kurz bewertet. 5.2.1 Destillative Anreicherung Die destillative Anreicherung von P und auch die Darstellung von Destillaten aus den eingesetzten Drogen im Labormaßstab (gem. Kapitel 4.1.2.1, S. 44) führten zu kaffeeartig, dumpf und hart riechenden Konzentraten, deren Geruch sich allerdings von dem der originären, unbehandelten, jungen Proben unterschied. Die folgende Abbildung 5-2 stellt das Total-Ion-Chromatogramm einer destillativ angereicherten Probe (A) dem des ursprünglichen Musters (B) gegenüber. Dabei wurde 1 µl der Proben flüssig injiziert und auf einer 50 m DB-Wax®-Kapillarsäule (0,32 mm ID, 1 µm FD) getrennt. Weitere Analysenparameter sind in Kapitel 4.2.5.1, S. 58, beschrieben. Ethanol COMP005 Monoterpene Sesquiterpene Scan EI+ TIC 5.00e6 100 % A leichtest flüchtige Verbindungen Eugenol Abb. 5-2: Gegenüberstellung von destillativ konzentriertem (A) und nicht behandeltem P (B). 0 COMP007 100 Scan EI+ TIC 5.00e6 B % 0 2.500 5.000 7.500 10.000 12.500 15.000 17.500 20.000 22.500 25.000 27.500 30.000 32.500 35.000 37.500 40.000 42.500 min Die Anreicherung der Monoterpenfraktion und der leichtest flüchtigen Verbindungen im Chromatogramm A im Vergleich zum Chromatogramm B ist erkennbar. Obwohl die Labordestillationen schwerer flüchtige Inhaltsstoffe von P wie Sesquiterpene oder aromatische Verbindungen wie Zimtaldehyd oder Eugenol aus der zweiten Chromatogrammhälfte nicht miterfassen und damit bei Screening-Analysen zu Beginn der Untersuchungen erhebliche stoffliche wie sensorische Informationsverluste zu akzeptieren waren, scheint die destillative Anreicherung für leichter flüchtige Verbindungen ein geeignetes, schonendes Anreicherungsverfahren zu sein (vgl. auch Kapitel 5.7.3, S. 120). - 72 - Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren 5.2.2 Extraktive Anreicherung Die Extraktion von P mit n-Pentan und die anschließende olfaktorische Bewertung der beiden Phasen ergab, dass die gerade extrahierte ethanolische Phase von P neben dem unvermeidbaren Pentangeruch nach wie vor den dumpfen, muffigen Geruch der ursprünglichen Probe trug, während der Rückstand der Pentanphase nach schonendem Verdampfen des Lösemittels bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck die sensorischen Merkmale einer alten, gelagerten Probe einwandfreien Aromas aufwies. Dieses Experiment war entscheidend für die Bewertung der Eignung von flüssig-flüssig Extraktionen mit unpolaren Lösemitteln zu Anreicherungszwecken und für die Bewertung von Literaturdaten zu ätherischen Ölpflanzen und deren Ölen. Es bewies einerseits, dass diese Methode für eine Anreicherung der hinsichtlich der vorliegenden Fragestellung interessierenden Aromakomponenten ungeeignet war, da sie offenbar diese Fraktion der Aromastoffe diskriminierte. Zusammen mit dem Verschwinden des Fehlgeruchs nach Wasserzugabe war das ein wesentlicher Hinweis auf den polaren Charakter potentieller, den Fehlgeruch verursachenden Substanzen (vgl. Kapitel 2.4, S. 17). Andererseits versagte es aber auch, Rückschlüsse und Erkenntnisse von sensorischen Aspekten ätherischer, offizinaler Öldrogen auf das vorliegende Problem zu projezieren, die unter Anwendung der beschriebenen Extraktionsmethode gewonnen worden waren (vgl. Kapitel 3.3, S. 26). 5.2.3 Kondensation in Kühlfallen Die Kondensation in Kühlfallen, die in Kapitel 4.1.2.3 (S. 45) vorgestellt wurde, führte entgegen den destillativen Anreicherungstechniken auch zur Kondensation schwerer flüchtiger Verbindungen. Das folgende TIC-Chromatogramm entstand nach einer 30-minütigen Beladung einer PTFE-Probenschleife bei - 75 °C mit flüchtigen Verbindungen eines jungen, unangenehm riechenden Musters von P. Dabei wurde die Probe in einer Gaswaschflasche mit Argon durchspült, wobei das Durchflussvolumen der Probenschleife 5 ml/min betrug. Abb. 5-3: Chromatogramm eines TrockeneisKondensats von P in einer PTFE-Probenschleife REODYN01 Scan EI+ TIC 1.43e8 100 Ausschnitt in nächster Abbildung % 0 Scan 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 - 73 - 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 Nr. Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren Wie in Abbildung 5-3 erkennbar, sind auch in der zweiten Hälfte des Chromatogramms Substanzen aus dem Gasraum kondensiert. Damit schien dieses Verfahren zunächst mehr Informationen als die destillativen Anreicherungstechniken zu liefern und daher bei Screening-Untersuchungen besser geeignet zu sein. Allerdings führte diese Technik zu einem Verlust und damit zu einer Diskriminierung von Methylmercaptan. Diese nachweislich im jungen P vorkommende Verbindung (vgl. Kapitel 5.4.1, S. 91), die bereits frühzeitig im Verdacht stand, am Zustandekommen des Fehleindrucks beteiligt zu sein, konnte in den Kondensaten nicht mehr detektiert werden. Die für diese Verbindung charakteristischen Massenspursumme m/z 47 und 48 zeigte zur Retentionszeit des Methylmercaptans keinen Peak (Abb. 5-4, A): Dimethylsulfid REODYN01 100 Scan EI+ 33+34+47+48 2.16e6 A Methylmercaptan ? % 0 Scan EI+ TIC 2.50e7 REODYN01 100 B % 0 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700 720 Scan Nr. Die Tatsache, dass kein Methylmercaptan trotz des festgestellten Konzentrierungseffekts beim Dimethylsulfid nachgewiesen werden konnte, führte zu dem Verdacht, dass auch weitere, leichtest flüchtige Schwefelverbindungen wie z.B. Schwefelwasserstoff sich durch diese Anreicherungstechnik dem Nachweis entziehen könnten. Ähnliche Schwierigkeiten beschreibt z.B. BURMEISTER et al. (1992, S. 56), der Verluste bei der Untersuchung von schwefelhaltigen Analyten, vor allem Schwefelwasserstoff, beim Kontakt mit Metallteilen während des Analysenganges festgestellt hat. Da die Experimente neben der Verwendung einer Stahlkapillare (SS304 Kanülenstahl, Fa. Hamilton) auch mit zwei Kunststoffprobeschleifen durchgeführt worden waren (PEEK® und PTFE), mit denen ebenfalls kein Nachweis von Methylmercaptan oder Schwefelwasserstoff möglich war, wurden die Untersuchungen mit dieser Anreicherungstechnik wegen des Verdachts eines zu hohen Artefaktbildungspotentials nicht weiter verfolgt. - 74 - Abb. 5-4: Niedermolekulare Schwefelverbindungen im Trockeneis-Kondensat von P (PTFEProbenschleife) A: Ionenspuren für Methylmercaptan und Schwefelwasserstoff B: TIC-Chromatogramm. (Ausschnitt aus Abb. 5-3) Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren 5.2.4 Festphasen-Mikroextraktion (SPME) Das Verfahren der Festphasen-Mikroextraktion zeichnete sich in erster Linie durch seine leichte Handhabbarkeit und eine hohe Reproduzierbarkeit aus. Die folgende Abbildung 5-5 macht die Reproduzierbarkeit durch Vergleich der Chromatogramme eines unfiltrierten, jungen mit einem 7 Jahre alten, filtrierten Muster deutlich. Hierbei wurde eine 100 µm CARBOXEN®-SPME-Faser verwendet, die 30 Minuten im Gasraum über der jeweiligen Probe beladen wurde, um anschließend im SSI-Injektor des Gaschromatographen bei geschlossenem Split und 220 °C 60 s lang desorbiert zu werden. MGCB206A Abb. 5-5: Vergleich einer alten, filtrierten Variante von P (A) mit einer jungen, unfiltrierten (B) nach SPME an Carboxen®. (TICChromatogramme) % Scan EI+ TIC 3.98e7 A 100 Ausschnitt vergrößert in nächster Abbildung 0 MGCB757U 100 Scan EI+ TIC 4.06e7 B % 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 Scan 4400 Da die Carboxen®-Faser speziell für die Analytik flüchtiger Schwefelverbindungen entwickelt worden war, sollte es möglich sein, diese auch im Dampfraum über P nachweisen zu können. Die Abbildung 5-6 zeigt aus den in Abb. 5-5 ersichtlichen Chromatogrammen lediglich die Summen der für die Verbindungen Schwefelwasserstoff, Methylmercaptan und Dimethylsulfid wesentlichen Ionenspuren m/z 33, 34, 47 und 48. Abb. 5-6: Vergleich einer alten, filtrierten Variante von P (A) mit einer jungen, unfiltrierten (B) nach SPME an Carboxen®. (Ionenspuren, Ausschnitt aus Abb. 5-5) MGCB206A 100 Scan EI+ 33+34+47+48 9.72e4 A % 0 MGCB757U Scan EI+ 33+34+47+48 1.00e5 B 100 Dimethylsulfid Methylmercaptan ? % 0 Scan 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 - 75 - 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren Die Auswertung ergab ein schwaches Signal von Dimethylsulfid (Abb. 5-6, B) für den Dampfraum über der jungen, unfiltrierten Probe. Methylmercaptan dagegen, das eine kürzere Retentionszeit als Dimethylsulfid aufweisen musste, konnte mit Hilfe dieser Technik erneut nicht nachgewiesen werden. Gleiches galt für Schwefelwasserstoff. Variationen der Beladungsdauer bzw. der Desorptionsbedingungen (Dauer/Temperatur) führten zu keiner Verbesserung der Nachweissituation des Methylmercaptans. Über der gelagerten, sensorisch einwandfrei riechenden Probe konnten keine der oben genannten Verbindungen detektiert werden (Chromatogramm A). Laut Mitteilung von Herrn Dr. Ingo Haag (Firma SUPELCO) ist bei hohen Alkoholkonzentrationen, gerade bei der auch adsorptiv arbeitenden Carboxen®Faser die Verdrängung der zu betrachtenden Schwefelverbindungen durch Ethanol zu erwarten. Eine empfohlene Verdünnung der Probe mit Wasser auf Alkoholgehalte unter 10 %(v/v) wurde jedoch wegen des verringenden Einflusses desselben auf den Fehleindruck nicht durchgeführt. Die weitere Anwendung der SPME-Anreicherungstechnik musste daher im vorliegenden Fall als ungeeignet angesehen werden. 5.2.5 Headspace/GC -Kopplungen und deren Einfluss auf die Probenaufgabe Bei den GCO-Untersuchungen (vgl. Kapitel 5.3.1, S. 85) war aufgefallen, dass die Wahrnehmbarkeit von Substanzen, die einen niedrigeren Siedepunkt als Ethanol besitzen, entscheidend von der Probenvorbereitung bzw. von der gewählten Probenaufgabetechnik abhing. Die folgende Abbildung 5-7 stellt drei Total-Ionen-Chromatogramme gegenüber, die sich in der Probenvorbereitung bzw. in der Aufgabetechnik unterscheiden. COMP007 100 % Scan EI+ TIC 2.50e7 Eugenol leichtest flüchtige Verbindungen Monoterpene Sesquiterpene Zimtaldehyd A 0 COMP005 Scan EI+ TIC 2.50e7 100 % B 0 HS__MS09 Scan EI+ TIC 2.50e7 100 C % 0 2.500 5.000 7.500 10.000 12.500 15.000 17.500 20.000 22.500 - 76 - 25.000 27.500 30.000 32.500 35.000 37.500 40.000 42.500 45.000 min Abb. 5-7: Vergleich von Flüssiginjektion (A), Destillation (B) und HeadspaceAnalyse (C) mittels GC/MS. Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren Das Chromatogramm A gibt den Chromatographieverlauf nach einer normalen Flüssiginjektion von P wieder. Deutlich sind die Peaks der Gruppe der Sesquiterpene, Zimtaldehyd und Eugenol im letzten Drittel des Laufes ab der 32. Minute zu erkennen. Das Chromatogramm B stellt die Flüssiginjektion derselben Probe dar, die zuvor destillativ im Volumenverhältnis 2:1 angereichert worden war. Hier macht sich ab Mitte des Chromatogramms bereits ein deutlicher Informationsverlust bemerkbar, während im Bereich leichtest flüchtiger Verbindungen keine großen Konzentrierungstendenzen bemerkbar sind. Eugenol ist überhaupt nicht mehr nachweisbar. Bei der direkt gekoppelten Headspace-Probenaufgabe (Chromatogramm C) dagegen ist eine sichtbare Anreicherung im ersten Drittel des Chromatogramms zu erkennen. Da die Dampfraumanalyse, insbesondere die Kopplungsart, einen großen Einfluss auf die Messergebnisse sowohl der instrumentellen als auch der mikro-olfaktorischen Analyse hatte, soll zunächst die Adaptation dieser Analysentechnik auf das vorliegende Problem beschrieben werden. Ziel war, die mittels Gleichdruckdosierung auf die Trennsäule zu bringende Probenmenge zu optimieren. Daher wird das Zusammenspiel zwischen Probentemperatur, Trägergasdruck, Druckgefälle und der Dauer der Injektionsphase sowie dessen Einfluss auf die chromatographische Trennung im Folgenden theoretisch erläutert, praktisch umgesetzt und ausgewertet. 5.2.5.1 Temperatur und Dampfdruck Die nebenstehende Graphik 5-8 zeigt, wie sich der Druck in einem HS-Vial über 5 ml des untersuchten Probenmaterials in Abhängigkeit der Temperatur verhält. Gemessen wurde der Druck mit einem Einstichmanometer in der Probe, die in einem Wasserbad mit einer Heizrate von 2°C/min erwärmt wurde. 120 Gleichgewichtsdruck p in kPa Abb. 5-8: Dampfdruckkurve von P, ermittelt mit einem Einstichmanometer 100 80 60 40 20 0 10 30 50 70 90 Temperatur t in °C Aus der Graphik ist ersichtlich, dass der Druck und damit die Menge an Verbindungen in der Gasphase mit zunehmender Temperatur ansteigt. Mit Hilfe der Druckmessung kann somit für den Headspace-Probengeber mit Gleichdruckdosierung der notwendige Säulenvordruck bestimmt werden, der bei gewünschter, offenbar möglichst hoher Probentemperatur mindestens an der Injektionsnadel anliegen muss, damit es beim Einstechen in das temperierte Proben-Vial nicht vorzeitig zu einem Druckausgleich und damit zu einer unerwünschten Doppelinjektion kommt. - 77 - Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren Grundsätzlich muss aber bei der Maximierung der Analytenmenge durch höhere Probentemperatur auch verstärkt mit Veränderungen der Analyten (Artefaktbildungen) gerechnet werden. Ähnliches gilt für die Dauer der Thermostatisierung bzw. Gleichgewichtseinstellung. Bei den Untersuchungen dieser Arbeit wurden die Proben in Anlehnung an HILTUNEN et al. (1985, S. 23) 20 Minuten thermostatisiert. 5.2.5.2 Trägergasdruck, Trägergasgeschwindigkeit und Injektionszeit Wenn sich mit dem durch die Temperaturerhöhung notwendigen, steigenden Säulenvordruck die lineare Trägergasgeschwindigkeit erhöht, erhöht sich auch jenseits des optimalen Bereichs der Kapillarsäule die theoretisch zu erzielende Bodenhöhe. Die Folge hiervon ist eine sinkende Trennleistung. Die optimale lineare Trägergasgeschwindigkeit lässt sich mit Hilfe der VAN DEEMTER-GOLAYGleichung1 berechnen. Für die verwendeten DB-WAX®Säulen liegt sie für das Trägergas Helium bei etwa 30 bis 40 cm/s. (vgl. Herstellerangaben J&W Scientific Installation Manual; HÜBSCHMANN, 1996, S. 97 ff.). Daher sollten durch einen Gassplit vor der analytischen Trennkapillare das Trägergasvolumen und somit dessen Durchflussgeschwindigkeit reduziert werden. Für den verwendeten, automatischen Headspace-Probengeber HS 40 (Fa. Perkin Elmer) wird empfohlen, nach der kurzen Gerätetransferstrecke HS-GC am GC-Split-Injektor durch Öffnen der Splitventile die nötige Reduktion des Säulenvordrucks und damit der linearen Trägergasgeschwindigkeit zu erreichen. Diese indirekte HS-Kopplung mit einer Drucksenke soll zudem den Vorteil haben, dass ein steileres Druckgefälle auf der kurzen Transferstrecke zwischen Probe und GC-Splitinjektor eingestellt werden kann, was wiederum die während der Injektion austretende Probenmenge vergrößern soll. Da die Injektionsdauer ohne Kryofokussierung nicht beliebig lang gewählt werden kann, weil die Peaktrennung durch lange Probenaufgabe leidet, ist bei der HS-Aufgabetechnik vor allem das zu erzielende Druckgefälle zu optimieren. Als maximale Injektionsdauer hinsichtlich der erzeugten Peakform und – auflösung wurden 7,2 Sekunden (0,12 Minuten) gewählt. 1 H = A – B/u + C · u mit H = Trennstufenhöhe, u = lineare Trägergasgeschwindigkeit A = Term der Streudiffusion, B = Term der gewöhnlichen Diffusion, C = Term der Massenaustauschverzögerung - 78 - Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren 5.2.5.3 Einfluss der Probentemperatur in der HS-Analyse Die folgende Graphik 5-9 stellt den bereits in Kapitel 5.2.5.1, S. 77, erwähnten Sachverhalt der Abhängigkeit der injizierbaren Probenmenge am Beispiel einiger ausgewählter, flüchtiger Monoterpene von der Probentemperatur bei HS-Analyse dar. Abb. 5-9: Nachweisbarkeit einiger Monoterpene in Abhängigkeit der Probentemperatur bei der HS-Probenaufgabe 3,50E+08 a-Pinen TIC 3,00E+08 C a m p h e n T IC ß-Pinen TIC 2,50E+08 Flächen abs. S a b inen TIC 2,00E+08 R (+)-Lim o n e n T IC 1,50E+08 1,00E+08 5,00E+07 0,00E+00 35 45 55 65 75 T e m p e ratur t in °C Die Graphik veranschaulicht den Anstieg der mittels GC/MS detektierbaren Probenmenge mit der Probentemperatur, der im Falle von R(+)-Limonen einen exponentiellen Verlauf aufweist. Als Konsequenz müsste bei den Untersuchungen die Probentemperatur so hoch wie möglich gewählt werden. Die Abhängigkeit der auf die chromatograpische Säule zu bringenden Methylmercaptanmenge von der Probentemperatur bei der Headspace-Analyse gibt die nächste Graphik wieder: 1800000 Methylmercaptan 47+48 1600000 1400000 Flächen (abs.) Abb. 5-10: Nachweisbarkeit von leich-test flüchtigen Verbindungen in Abhängigkeit der Probentemperatur bei der HSProbenaufgabe Dimethylsulfid 47+48 1200000 Ameisensäureethylester 47+48 1000000 800000 600000 400000 200000 0 35 45 55 Temperatur t in °C - 79 - 65 75 Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren Wider Erwarten ist die Nachweisbarkeit für Methylmercaptan von der Probentemperatur fast unabhängig bzw. sinkt sogar etwas bei höheren Temperaturen. Eine Erklärung hierfür wurde in der hohen Flüchtigkeit des Methylmercaptans (Siedepunkt: + 6 °C) vermutet, die bereits bei Raumtemperatur zum vollständigen Phasenübertritt aus kleinen Probenvolumina führen könnte. Als weiterer Grund kann die bekannte hohe Reaktivität der Verbindung angeführt werden. Eine Temperaturerhöhung bei der Analytik von Methylmercaptan zum Zwecke der Steigerung der Verfahrensempfindlichkeit war deshalb also nicht mehr anzustreben. Als optimale Probentemperatur sowohl für die Verfolgung weiterer Probenbestandteile in der Gasphase bei Screening-Untersuchungen als auch für die Bestimmung des Methylmercaptans wurde daher 65 °C gewählt. 5.2.5.4 Einfluss des Probenvolumens in der HS-Analyse Für die Headspace-Untersuchungen wurden die Proben in spezielle Headspace-Vials mit einem Nennfüllvolumen von 22,0 ml gefüllt und gasdicht unter Verwendung spezieller Septen und Aluminiumkappen verbördelt. Das maximal zulässige Füllvolumen war aufgrund der Einstichtiefe der Injektionsnadel auf 15,0 ml begrenzt. Um die optimalen Dosierbedingungen zu ermitteln, wurden daher Vials mit unterschiedlichen Volumina von P befüllt und bei konstanter Temperatur von 65 °C während 20 Minuten temperiert. Die Ergebnisse der ermittelten Peakflächen von einigen Terpenkohlenwasserstoffen in Abbildung 5-11 und von den sehr leicht flüchtigen Schwefelverbindungen Methylmercaptan und Dimethylsulfid in Abbildung 5-12 sind exemplarisch dargestellt. 80000000 70000000 a-Pinen y = -177796x2 + 3E+06x + 6E+07 60000000 Fläche 50000000 Camphen 2 y = -106506x + 2E+06x + 4E+07 40000000 30000000 ß-Pinen 20000000 y = -38960x2 + 692045x + 2E+07 10000000 y = -68853x2 + 856454x + 2E+07 0 0 5 10 15 Füllvolumen in ml - 80 - Sabinen Abb. 5-11: Nachweisbarkeit von Monoterpenen in Abhängigkeit der Probenfüllmenge bei der HSAnalyse. Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren Abb. 5-12: Nachweisbarkeit von leichtest flüchtigen Verbindungen in Abhängigkeit der Proben-Füllmenge bei der HS-Analyse. 1400000 Methylmercaptan Dimethylsulfid 1200000 Ameisensäureethylester 1000000 2 Fläche y = -3795,6x + 54427x + 1E+06 800000 2 600000 y = -3578,6x + 60588x + 512305 400000 200000 y = -13959x + 334753 0 0 5 10 15 Füllvolumen in ml Wie schon beim Einfluss der Probentemperatur festgestellt, verhält sich Methylmercaptan auch hinsichtlich des Probenvolumens ebenfalls anders als andere flüchtige Inhaltsstoffe von P. Der Gehalt an Methylmercaptan im dosierten Dampfraumaliquot nimmt mit steigendem Probenvolumen und sinkendem Dampfraumvolumen ab. Eine Erklärung hierfür kann nicht gegeben werden. Für die relative Gehaltskonstanz von Methylmercaptan bei Erhöhung der Probentemperaturen (vgl. Kapitel 5.2.5.3, S. 79) kann die hohe Flüchtigkeit allerdings nicht mehr als Grund angeführt werden. Bei allen übrigen Substanzen steigen zunächst die Gehalte im Dampfraum mit der Probenmenge im Vial an, um nach Überschreitung eines optimalen Füllvolumens wieder abzufallen. Dieses Optimum liegt für ß-Pinen bei 6,2 ml/Vial (Minimum) und für Camphen bei 9,3 ml/Vial (Maximum). Der Durchschnittswert aller sechs ausgewerteten Verbindungen liegt bei 8,0 ml/Vial, was als optimale Füllmenge angesehen wurde. Füllvolumina über 10 ml/Vial führten im oberen Temperaturbereich bei 65 °C mitunter zu unkontrollierten Doppelinjektionen und wurden daher vermieden. 5.2.5.5 Indirekte HS/GC/MS-Kopplung Die ersten Versuche mit dem HS 40 zeigten deutlich, dass die Peakflächen der Terpenkohlenwasserstoffe mit steigender Probentemperatur stark zunahmen. Der damit verbundene hohe Dampfdruck musste, dem HS-Prinzip der Gleichdruckdosierung folgend, durch den Trägergasvordruck übertroffen werden, um Doppelinjektionen zu verhindern. Daher wurde zunächst die Trägergasversorgung direkt über den HS-Autosampler vorgenommen und die bei Probentemperaturen zwischen 70 und 80 °C notwendigen Säulenvordrücke von bis zu 100 kPa am GC durch Öffnen der Splitventile reduziert. Bei SplitRaten zwischen 40:20, 30:15 und 21:7 ml/min wurde der Vordruck im GC-In- 81 - Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren jektor auf 50 bis 60 kPa und damit auf eine optimale lineare Trägergasgeschwindigkeiten zwischen 30 bis 35 cm/s eingestellt. Die theoretisch ableitbare Verbesserung der Empfindlichkeit dieser Aufgabetechnik durch Maximierung der Probentemperatur und Optimierung des Druckgefälles, die praktisch anhand der flüchtigen Terpene bestätigt werden konnte, galt allerdings nicht für die leichtest flüchtigen Schwefelverbindungen. Vor allem das Nachweisverhalten des Methylmercaptans war geprägt von entgegen diesen Erwartungen ablaufenden Veränderungen, die bereits in den Kapiteln 5.2.5.3 und 5.2.5.4 (S. 79 und 80) angesprochen wurden und letztendlich zur Favorisierung der direkten HS/GC-Kopplung führten. 5.2.5.6 Direkte HS/GC-Kopplung Bei splitloser Injektion, bei der die Transferkapillare mit der Trennkapillare direkt über einen Kapillarsäulenverbinder (GRAPHPACK D3/2- oder besser Press-Fit-Säulenverbinder) verbunden wurde, konnte die Nachweisbarkeit für Methylmercaptan im Gasraum derart erhöht werden, dass in nahezu allen untersuchten, jungen, unfiltrierten Proben Methylmercaptan sensorisch wie instrumentell nachgewiesen werden konnte. Die Abbildung 5-13 stellt ein TIC-Chromatogramm mit indirekter HS-Kopplung (A) dem einer direkten Kopplung (B) gegenüber. HS30C3 100 Scan EI+ TIC 5.00e6 Ausschnitt in nächster Abbildung A % 0 HS__30C3 Scan EI+ TIC 5.00e6 100 B % 0 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 40.000 45.000 50.000 55.000 60.000 65.000 70.000 min Im mittleren Bereich des Chromatogramms B, ab der 25. Minute, ist bei der direkten Kopplung ein quasi vollständiger Informationsverlust zu verzeichnen. Im Bereich der leichtest flüchtigen, schwefelhaltigen Substanzen ist hingegen alleine durch die direkte Verbindung der Transfer- mit der Trennkapillare (Abbildung 5-14, Chromatogramm B) eine Verdopplung der Peakflächen von Methylmercaptan und Dimethylsulfid gegenüber der indirekten Kopplung (A) zu erkennen. - 82 - Abb. 5-13: Vergleich von indirekter (A) und direkter (B) HSKopplung Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren HS30C3 Abb. 5-14: Ausbeuten von schwefelhaltigen Verbindungen bei indirekter und direkter HS-Kopplung. (Ionenspuren, Ausschnitt aus Abb. 5-13) Scan EI+ 47+48+62 1.00e5 A 100 Methylmercaptan Ethylformiat Dimethylsulfid Ethylacetat % 0 HS__30C3 Scan EI+ 47+48+62 1.00e5 B 100 % min 0 3.500 4.000 4.500 5.000 5.500 6.000 6.500 7.000 7.500 8.000 8.500 9.000 9.500 10.000 10.500 11.000 Die folgende Graphik (Abb. 5-15) gibt eine Übersicht über die mittels GC/MS erzielten absoluten Peakflächen ausgewählter Substanzen in Abhängigkeit der Aufgabetechnik. Abb. 5-15: Nachweisverhalten einiger aromarelevanter Verbindungen in P in Abhängigkeit der Aufgabetechnik 10000000000 SSI 1000000000 HS (indirekt) 100000000 HS (direkt) 10000000 Faktor (direkt/indirekt) Peakfläche 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 0,1 0,01 Eugenol Linalool 1,8-Cineol Limonen ß-Myrcen Camphen a-Pinen Ethylformiat Dimethylsulfid Methylmercaptan 0,001 Die Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit durch die Split-Flüssiginjektion (SSI) ist bei allen Verbindungen mit einer höheren Flüchtigkeit als der des Ethylformiats (Methylmercaptan und Dimethylsulfid) deutlich zu erkennen. Bei 1,8-Cineol ist die detektierte Peakfläche durch die HS-Technik bereits um drei Größenordnungen kleiner als nach einer Flüssiginjektion der gleichen Probe. Für die beiden schwefelhaltigen Verbindungen Methylmercaptan und Dimethylsulfid gilt dies nicht: So führt die HS-Probenaufgabe im Vergleich zur Flüssiginjektion zu mehr als um zwei Größenordnungen größeren Peakflächen. - 83 - Ergebnisse: Bewertung von Anreicherungsverfahren Der Einfluss der Kopplungsart auf die Ausbeuten der flüchtigen Analyten wird durch den untersten Graph in Abbildung 5-15 (Faktor direkt/indirekt) verdeutlicht. Der Graph leitet sich aus dem Quotienten der Peakfläche bei direkter und bei indirekter HS-Kopplung ab. Liegt der Wert über 1, ist die direkte Kopplung der indirekten überlegen. Dies ist allerdings wiederum nur bei leichtest flüchtigen Verbindungen der Fall. Eugenol und in abgeschwächter Form bereits 1,8-Cineol und Linalool können durch die direkt gekoppelte Headspace-Aufgabe so gut wie nicht mehr nachgewiesen werden. - 84 - Ergebnisse: Mikro-olfaktorische Merkmale von P 5.3 Mikro-olfaktorische Merkmale von P 5.3.1 Ergebnisse der GCO Während der GCO-Untersuchungen und der AEVA wurden die sensorisch relevanten Verbindungen des Vielstoffgemisches P erstmals registriert und vor dem Hintergrund des zu untersuchenden Fehleindrucks bewertet. Hierbei kamen nur Muster mit den makro-olfaktorisch größten Unterschieden zum Einsatz: unfiltrierte, junge Muster, filtrierte, alte Muster und destillativ angereicherte unfiltrierte, junge Muster (vgl. Kapitel 5.1.8, S. 70). Abb. 5-16: Aromagramm von P Die gerahmten Gerüche kennzeichnen unangenehm empfundene Assoziationen. Das abgebildete Aromagramm (Abb. 5-16) weist alle bei den GCOund AEVA-Untersuchungen wiederholt registrierten Geruchsassoziationen aus. Sie werden einem simultan aufgenommenen FID-Chromatogramm zugeordnet. Die Aufnahmeund Analysenparameter wurden in Kapitel 4.2.2.3, S. 54 genannt. - 85 - Ergebnisse: Mikro-olfaktorische Merkmale von P In den ersten 6 Minuten des Aromagramms traten drei Geruchsassoziationen auf, die als „merkwürdig muffig" und „unangenehm“ empfunden wurden. Der erste, bei 3,2 Minuten empfundene Geruch, konnte zunächst olfaktorisch nicht identifiziert werden (vgl. hierzu Kapitel 5.7, Schwefelwasserstoff, S. 116). Nach 5 Minuten wurde in destillativ angereicherten Proben bzw. bei der direkten HS-Kopplung als zweite Geruchsassoziation der Geruch des Methylmercaptans erkannt, der dem Fehleindruck an P ausgesprochen ähnlich zu sein schien. Die letzte Wahrnehmungen bei 5,6 Minuten wurde aufgrund des auffälligen, unangenehmen Geruchs als Dimethylsulfid identifiziert. Im weiteren Verlauf wurden noch drei weitere, wenig angenehme mikro-olfaktorische Eindrücke registriert: Retentionszeit [min] Geruchsassoziation 22,5 feuchter, leicht muffiger Geruch 26,0 Geruch nach kalten, gekochten Kartoffeln 30,3 Geruch nach Schweiß, typisch nach Baldrian Die bei Minute 22,5 und 26,0 assoziierten Gerüche konnten mittels MS-Spektren-Vergleich bisher nicht sicher identifiziert werden. Der Verdacht, der kartoffelartige Geruch bei 26,0 min könnte durch Methional verursacht werden, konnte instrumentell-analytisch nicht bestätigt werden. Die sensorische Zuordnung der Empfindung bei 30,3 Minuten zur Isovaleriansäure konnte dagegen anhand eines Retentionszeitenvergleichs mit der Referenzsubstanz abgesichert werden. Bei der praktizierten Injektionstechnik, bei welcher analog zur AEVA ein definiertes Volumen des Untersuchungsmaterials flüssig über einen Split/Splitless-Injektor verdampft und analysiert wurde, konnten zwischen den definierten, makro-olfaktorischen Zuständen mittels GCO keine sensorischen Unterschiede sicher erkannt werden. Das Auftreten der drei ersten Verbindungen im Aromagramm war zu uneinheitlich, als dass eine sichere Unterscheidung zwischen den Mustern möglich gewesen wäre. Grundsätzlich ließ sich für den Bereich der Substanzen mit einer kleineren Retentionszeit als der des Ethanols feststellen, dass dieser Bereich bei der normalen GCO-Flüssiginjektion durch relativ schlecht wahrzunehmende Geruchsreize gekennzeichnet war. Der bereits in Kapitel 5.2.5.6, S. 82, aus instrumentell-analytischen Daten abgeleitete Vorteil der direkten HS-Kopplung für den Nachweis leichtest flüchtiger Verbindungen wird durch die mikro-olfaktorischen Wahrnehmungen bestätigt. - 86 - Ergebnisse: Mikro-olfaktorische Merkmale von P 5.3.1.1 Marker-Substanzen bei der Gaschromatographie-Olfaktometrie Die Substanzen, die im Aromagramm von P aufgrund ihres typischen Geruchs eindeutig identifizierbar waren, werden in dieser Arbeit als Marker-Substanzen bezeichnet. Sie dienten als Hilfsmittel bei der Übertragung olfaktorischer Daten aus den Aromagrammen auf die FID- und MS-Chromatogramme und zur Überprüfung der zeitlichen Übereinstimmung (Synchronie) zwischen Chromatogramm und Aromagramm. Die Substanzen, die sich über den gesamten Retentionszeitenbereich verteilten, sind in der folgenden Tabelle aufgeführt: Rt [min] Marker-Substanz CAS-Nummer Geruchsassoziation 5,6 Dimethylsulfid 75-18-3 süßlich, schwer, nach saurer Milch 16,0 ß-Myrcen 123-35-3 typisch nach Geranien 17,8 1,8-Cineol 470-82-6 frisch, nach Eucalyptus 25,3 Essigsäure 64-19-7 typisch nach Essig, sauer 27,3 Linalool 78-70-6 typisch nach PENATEN®-Creme 30,3 Isovaleriansäure 503-74-2 unangenehm nach Schweiss, geruchliches Prinzip des Baldrians 39,9 Zimtaldehyd 104-55-2 süß, nach Zimt 42,0 Eugenol 97-53-0 typisch nach Nelke Die Registrierung dieser Verbindungen im Aromagramm belegte die fehlerfreie Funktion des GCO-Systems. 5.3.1.2 Headspace/GCO Die Intensität der olfaktorischen Wahrnehmung im vorderen Aromagramm-Bereich, in dem die Flüchtigkeit der Verbindungen größer ist als die des Lösemittels Ethanol, konnte sowohl durch erneute Destillation als auch durch die direkte Headspace/GCO-Kopplung verstärkt werden. So wurde bei den Untersuchungen mit dieser Aufgabetechnik stets der unangenehme Geruch des Dimethylsulfids registriert. Auch die Identifizierung des zuvor nur in Destillaten von P bereits unangenehm aufgefallenen Geruchs des Methylmercaptans gelang in fast jeder unfiltrierten, jungen Probe. Der hinsichtlich der Retentionszeit erste, bei den GCO-Untersuchungen als merkwürdig muffig empfundene Geruchseindruck konnte dagegen weder identifiziert noch einem makro-olfaktorischen Zustand von P zugeordnet werden (vgl. Kapitel 5.7, S. 116). - 87 - Ergebnisse: Mikro-olfaktorische Merkmale von P 5.3.2 Ergebnisse der Aromaextraktverdünnungsanalyse Bei den AEVA-Untersuchungen wurden Verdünnungen einer sensorisch wenig präferierten, unfiltrierten, jungen Probe mit einer sensorisch einwandfreien verglichen. Während des Abriechens wurden nur Geruchsassoziationen und die Retentionszeit registriert. Es wurde parallel kein FID-Chromatogramm aufgezeichnet, was die Empfindlichkeit der Analyse verdoppelte. Die Dynamik und Varianz, die die Geruchsempfindungen beim Abriechen der Verdünnungen aufwiesen, waren wichtige Anhaltspunkte für die Bewertung der Wahrnehmung einer Verbindung im Aromagramm. Die Ergebnisse werden in Abbildung 5-17 zusammengefasst, die Analysenparameter, die zu den Geruchsassoziationen führten, wurden in Kapitel 4.2.3 (S. 56) angeführt: Verdünnungsfaktor 0 20 40 muffig ? muffig, gärig kohlig, nach saurer Milch medizinisch würzig, dumpf alkoholisch tannig, harzig frisch, kühl Geruchsassoziationen würzig, trocken würzig, trocken würzig, trocken nach Geranien frisch, citrusartig nach Eucalyptus nach Benzin, terpenig erdig, pilzig nach Klebstoff (UHU) feucht, leicht muffig, grün angenehm, nach Kakao nach Gemüse nach Gemüse (Fortsetzung nächste Seite) - 88 - 60 80 100 120 140 160 180 200 Abb. 5-17: Verdünnungsfaktoren von mikroolfaktorichen Merkmalen von P Ergebnisse: Aromaextraktverdünnungsanalyse AEVA Abb. 5-17: Verdünnungsfaktoren von mikroolfaktorischen Merkmalen von P (Fortsetzung) Verdünnungsfaktor 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 nach Zimt, citrusartig nach Essig, sauer feucht, gekochte, kalte Kartoffeln Krankenhaus, Desinfektionsmittel nach Penaten®-Creme nussig Geruchsassoziationen Schweiß, typisch getoastetes Brot angenehm, nach Kakao Zitrone süß, Zitrone, Orange süß, dumpf, schwer süß, dumpf, schwer Zitrone sauer, kalt, metallisch sauer, kalt, metallisch sauer, kalt, metallisch nach heißem Gummi nach Orangen, frisch (TIC TAC®) typisch nach Zimt nach Nelke Bei den Untersuchungen konnten 36 verschiedene, olfaktorische Reize registriert und beschrieben werden. Auf eine getreue Darstellung der Zeitachse des Aromagramms musste aus graphischen Gründen verzichtet werden. Sich wiederholende Geruchsassoziationen, die in einem gewissen, kurzen Zeitfenster von etwa 60 Sekunden diskrete Reize auslösten und daher keiner konstanten Retentionszeit zugeordnet werden konnten, sind in Abbildung 5-17 mehrfach genannt. - 89 - Ergebnisse: Mikro-olfaktorische Merkmale von P Die Verbindungen mit den höchsten Verdünnungsfaktoren zählten zu der Gruppe der Marker-Substanzen, deren Identität bereits aufgrund ihO res mikro-olfaktorischen Geruchs OH mit hoher Sicherheit erkannt worden war. Die Identifizierung über Ethanol 1,8-Cineol MS-Spektren-Vergleiche und dem mikro- bzw. makro-olfaktorischen Vergleich mit Referenzsubstanzen H C OH OH führte schließlich zu dem Ergebnis, CH O dass der Geruch von P hauptsächlich durch die vier Verbindungen 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol in Ethanol geprägt wird. 3 3 Linalool Eugenol Der Geruch jeder dieser Verbindungen wird als angenehm, frisch und harmonisch beschrieben. Der unangenehme Geruchseindruck junger Proben konnte nicht mit diesen Duftstoffen in Verbindung gebracht werden. Dafür prägen sie nachweislich das produkttypische Aroma von P. So konnte eine Lösung von 15 mg 1,8-Cineol, 3 mg Linalool und 150 mg Eugenol in 100 ml Ethanol einen an P erinnernden würzigen Geruchseindruck vermitteln und das produkttypische, olfaktorische Bild von P imitieren. Die Aromaintensität dieser Verbindungen mit Verdünnungsfaktoren zwischen 100 und 160 war im Vergleich zu den als unangenehm empfundenen Geruchsassoziationen wesentlich größer. Bei den eher negativ empfundenen Geruchseindrücken wurde der Isovaleriansäure mit 20 der höchste Verdünnungsfaktor in dieser Gruppe zugewiesen. Obwohl es auch bei den AEV-Analysen nicht gelang, signifikante mikro-olfaktorische Unterschiede zwischen makro-olfaktorischen Zuständen zu entdekken, schien dieser Befund mit einer Eindeutigkeit auf die im Geruch angenehm empfundenen Substanzen hinzuweisen, dass aufgrund der theoretischen Überlegungen zur Zielsetzung der Aromaextraktverdünnungsanalyse ein Einfluss auf den Fehlgeruch vermutet werden musste. Demnach hätten die olfaktorischen Veränderungen während der Lagerzeit auf der Bildung dieser Verbindungen beruhen müssen (vgl. Kapitel 3.2, S. 23 und 3.6.3, S. 40), was im Folgenden allerdings nicht bestätigt werden konnte. - 90 - Abb. 5-18: Produktaromaprägende Verbindungen in P Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 5.4 Ergebnisse der instrumentellen Analytik 5.4.1 HRGC/MS-Untersuchungen Die folgende Graphik zeigt die Total-Ionen-Chromatogramme zweier unterschiedlich lange gelagerten und sich makro-olfaktorisch stark unterscheidenden Chargen von P. Als Trennsäule wurde eine DB-WAXetr® 60 m Medium-Bore-Säule, Filmdicke 1 µm, verwendet. Weitere Analysenparameter wurden im Kapitel 4.2.5.1, S. 58, beschrieben. Abb. 5-19: TIC-Chromatogramme von unterschiedlich lange gelagertem P A: neun Jahre, B: ein Tag MG043511 Scan EI+ TIC 1.40e7 100 A % 0 MG903259 Scan EI+ TIC 1.40e7 100 B % 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 5400 5600 Scan Nr. Bei erster Betrachtung der beiden Chromatogramme fällt die hohe Übereinstimmung und die für ein Naturprodukt geringe Zahl von Variationen auf. So enthält die 9 Jahre alte Probe (Chromatogramm A) offenbar lediglich mehr Ethylacetat (Scan 600), Sabinen (Scan 1440) und Myristicin (Scan 5330), dagegen weniger Zimtaldehyd (4770). In Kapitel 5.4.2, „Stoffliche Veränderungen während der Lagerzeit“, S. 96, wird geklärt werden, ob diese Variationen tatsächlich signifikante Abweichungen darstellen. Die folgende Tabelle gibt erstmals eine Übersicht aller in P durch Vergleich mit MS-Spektren der WILEY-Bibliothek (Version 6, 1996, John Wiley & Sons), der NIST-MS-Spektrenbibliothek (1992, US Dept. of Commerce) bzw. mit selbst aufgenommenen Spektren identifizierbaren Substanzen. Das Ziel der Aufstellung ist dabei, die bei der GCO bzw. AEVA auffällig gewordenen mikro-olfaktorischen Merkmale konkreten Verbindungen zuzuordnen2. Die aufgeführten Verbindungen decken dabei durchschnittlich 99 % der gesamten detektierten und integrierten Peakflächen ab (vgl. Spalte „Area %“). 2 Ein Abgleich der aufgeführten Substanzen mit Literaturdaten über die chemische Zusammensetzung der bei P verwendeten Einzeldrogen kann aus markenschutzrechtlichen Gründen nicht gegeben werden. - 91 - Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Die erste Spalte gibt die Scan-Nummer an, die mit der Zeitachse der in Abbildung 5-19 dargestellten Chromatogramme übereinstimmt. Die Substanzen, die nur aufgrund des Spektrenvergleichs genannt werden können, sind mit der Abkürzung „MS“ versehen. Ein "R" kennzeichnet die Absicherung der Identität über die Retentionszeit mit einer Referenzsubstanz. Ein "S" weist darauf hin, dass die Substanz über ihre olfaktorischen Eigenschaften identifiziert worden ist. Die Spalte „Geruch der Referenz“ lehnt sich in den Fällen, in denen keine Referenz vorlag, an die Geruchsbeschreibungen von BAUER, GARBE und SURBURG (1997, Common Fragrance and Flavour Materials). Haben Substanzen, die über MS-Spektren nur unzureichend identifiziert werden konnten, einen mit Literaturdaten vergleichbaren mikro-olfaktorischen Geruch, sind sie mit einem Fragezeichen versehen. Nr. Komponente Identifizierung Geruch der Referenz Area % MS ? R 93 Hexan MS R 130 Isopren MS 165 Methylmercaptan MS R 195 Acetaldehyd MS R 265 Dimethylsulfid MS R 346 Propanal MS 0,001 357 Furan MS 0,001 394 Isobutyraldehyd MS 0,001 406 Aceton MS R 427 Ethylformiat MS R 547 2-Methylfuran MS 597 Ethylacetat MS R 698 Isovaleraldehyd MS R S würzig, dumpf 739 Ethanol MS R S Ethanol 1037 Tricyclen MS 1089 α-Pinen MS 1100 3-Thujen MS 1256 Camphen MS 1394 ß-Pinen MS 1443 Sabinen MS 1473 Verbenen MS 1564 (+)-3-Caren MS R 1606 ß-Myrcen MS R 1638 α-Phellandren MS R 70 Schwefelwasserstoff, Nachweis S GCO 0,001 muffig Kapitel 5.7 0,032 0,007 S muffig, gärig typisch 0,001 0,137 S kohlig, nach saurer Milch kohlig 0,012 0,040 0,148 medizinisch 0,001 1,044 0,035 alkoholisch 34,48 0,026 R S tannig, harzig harzig 1,420 0,056 R S erfrischend angenehm 0,725 würzig, trocken R frisch, kühl leicht harzig, terpenig 0,679 0,988 würzig, trocken - 92 - würzig, trocken 0,013 0,346 S nach Geranien 0,598 0,235 Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Nr. Komponente Identifizierung GCO Geruch der Referenz frisch, citrusartig nach Coriander, citrusartig 1703 α-Terpinen MS 1742 2-Heptanon MS 0,016 1773 6-Methyl-3,5-heptadien-2-on MS 0,004 1788 R(+)-Limonen MS 1837 ß-Phellandren MS 1850 1,8-Cineol MS R 1987 δ-Terpinen MS R 2027 2-Heptylacetat MS 0,026 2092 m-Cymen MS 0,007 2107 p-Cymen MS R s R nach Orange 0,280 11,81 1,192 R S 1,021 nach Eucalyptus 0,532 S nach Benzin, terpenig nach Benzin 0,372 0,005 2121 Unbekanntes Terpen 2149 Terpinolen MS 2185 Sabinenhydrat ? MS 2280 3,3-Dimethylallylalkohol MS 2316 1-Terpineol MS 2367 6-Methyl-5-hepten-2-on MS 2431 2,6-Dimethyl-5-heptenal ? MS feucht, leicht muffig, grün, nach Melone grün bzw. Gurke 0,004 2489 Verbenylether ? MS angenehm, nach Kakao 0,079 2554 2-Nonanon ? MS nach Gemüse 2596 3-Methyl-2-(2-methyl-2-butenyl)- MS 0,017 2613 α-Butoxyethanol ? MS 0,003 2622 Octanalacetal ? MS 0,001 2673 3-(4-Methyl-3-pentenyl)-Furan, MS 0,005 0,119 erdig, pilzig cis=Geruch n. Majoran, frisch, tr=minzig, frisch 0,021 0,009 0,024 nach Toluol unauffällig blumig, fettig 0,084 0,022 Furan, Rosenfuran ? Perillen ? 2674 Tetrahydrogeraniol ? MS 2741 1-Octen-3-ol MS 2779 Essigsäure MS 2814 α-Cubeben MS 0,014 2858 δ-Elemen MS 0,008 2873 Linalooloxid? Methional konnte MS nach Zimt, citrusartig wachsiger, Rosenblüte 0,005 0,008 R S S nicht nachgewiesen werden R nach Essig, sauer nach Essig 0,014 erdig-blumig, bergamottartig 0,013 nach frischem Brot feucht, nach gekochten, kalten Kartoffeln 0,100 2888 Furfurylaldehyd MS 2950 Cyclosativen MS 0,032 2967 α-Copaen MS 0,303 3040 2-Acetylfuran MS - 93 - Krankenhaus, Des- balsamisch infektionsmittel, nach Zitrone? 0,004 Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Nr. Komponente Identifizierung GCO Geruch der Referenz 3047 Savial-4(14)-en-1-on MS 3089 Linalool MS R 3125 Campher MS R 3224 Diethylmalonat MS 3240 Santalen MS 0,009 3273 Bergamoten MS 0,058 3291 Isobornylacetat MS 3305 ß-Elemen MS 3352 4-Terpineol MS 3371 trans-Caryophyllen MS 3464 Isovaleriansäure MS 3497 Citronellylacetat MS 0,085 3510 Bornylaldehyd MS 0,001 3524 Furfurylalkohol ? MS 3573 Myrcenol MS 3586 unbek. Sesquiterpenalkohol MS 3602 Benzoesäureethylester MS 3622 α-Humulen MS 3651 Neral MS 3666 α-Terpineolacetat MS 3692 Borneol ? MS 3718 Zingiberen MS 3740 Bisabolen MS R 1,117 3770 Valencen MS R 0,537 3782 Isocaryophyllen MS R 0,296 3804 Geranial MS 3823 10-α-Selina-4(19), 11-dien MS 3843 α-Sinensal MS 3870 δ-Cadinen MS 0,174 3889 ß-Sesquiphellandren MS 1,536 3899 ar-Curcumen MS 0,903 3980 Hydrozimtaldehyd ? MS süß, dumpf, schwer 3994 Benzoesäuremethylester ? MS süß, dumpf, schwer 4019 Sabinol MS 4075 Geraniol MS 4140 α-Bisabolol ? MS 0,001 S 0,221 Penaten®-Creme 0,029 0,004 nuss- kaffeeartig R 0,070 0,127 R 0,706 6,959 R S nach Schweiß nach Baldrianwurzel 0,008 schwach verbrannt 0,022 schwach nach Citrone nach geröstetem Brot 0,004 0,018 angenehmer Geruch 0,037 0,882 R 0,336 0,181 R 0,132 angenehm, nach Kakao 4,377 - 94 - S 0,341 Citrone 0,127 süß, nach Citrone oder Orange süß, orange 0,040 0,031 angenehmer Geruch 0,038 0,032 s 0,178 Zitrone sauer, kalt, metallisch kamillenartig 0,006 Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Nr. Komponente Identifizierung S 4197 unbekannte Substanz GCO Geruch der Referenz sauer, kalt, metallisch 0,004 0,011 4220 p-Isopropyl-Benzaldehyd MS sauer, kalt, metallisch 4240 Benzylalkohol ? MS nach heissem Gummi 4267 Safrol MS leicht süß R 0,007 S 4392 unbekannte Substanz 0,014 nach Orange, frisch (TIC TAC®) 0,002 4623 Caryophyllenoxid MS 4768 Zimtaldehyd MS R S nach Zimt 1,088 5059 Eugenol MS R S nach Nelke 20,27 5263 Eugenolacetat MS R S schwächer nach Nelke 0,686 5327 Myristicin MS R 0,042 0,047 Von den 36 bei der GCO und der AEVA in P registrierten geruchsaktiven Substanzen können 21 aufgrund der Ergebnisse der instrumentellen Analyse auf konkrete Verbindungen zurückgeführt werden. Diese werden im Folgenden, nach ihrer subjektiven, geruchlichen Präferenz unterteilt, aufgeführt. Fehlgeruchssubstanzen Schwefelwasserstoff3 Methylmercaptan Dimethylsulfid Isovaleraldehyd Isovaleriansäure Substanzen mit indifferentem Geruch Ethylformiat Ethanol β-Myrcen p-Cymen Essigsäure Substanzen mit eher angenehmem Geruch α-Pinen Camphen α-Terpinen 1,8-Cineol 1-Terpineol Linalool Geranial Geraniol Zimtaldehyd Eugenol Eugenolacetat Während ein Beteiligung von Methylmercaptan, Schwefelwasserstoff und Dimethylsulfid an der Ausprägung des anfänglichen Fehleindrucks an P vom Charakter ihres Eigengeruchs für möglich gehalten werden kann, prägen die Verbindungen 1,8-Cineol, Linalool, Eugenol zusammen mit Ethanol nachweislich das produkttypische Aroma von P (vgl. Kapitel 5.3.2, S. 88). 3 Nachweis und Zuordnung von Schwefelwasserstoff als Fehlgeruchssubstanz in P erfolgen erst in Kapitel 5.7, S. 116. - 95 - Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Welche dieser geruchsaktiven Verbindungen nun für die beobachteten olfaktorischen Veränderungen bei P mit verantwortlich gemacht werden können, wird im Folgenden untersucht. 5.4.2 Stoffliche Veränderungen während der Lagerzeit Eine notwendige Voraussetzung für die Auswahl problemrelevanter, geruchsaktiver Substanzen stellt die Veränderung ihres instrumentell detektierbaren Signals während der Lagerdauer dar (vgl. Kapitel 3.6.4, S. 41). Daher wurden die Total-Ionen-Chromatogramme von fünf Produktionschargen mit einem Durchschnittsalter von 7 Jahren mit relativ jungen Chargen verglichen. Die Labormuster dieser Chargen waren direkt nach der Produktion bei -21 °C eingelagert worden, um eine Verbesserung des Geruchseindrucks zu verzögern. Nach Aufnahme der Massenspektren wurden alle Chromatogramme in gleicher Weise automatisch integriert. Die einzelnen Peakflächen der alten und der neuen Chargen wurden innerhalb der Altersgruppe aufgrund der Scanzeiten einander zugeordnet und gemittelt. Anschließend wurden analog die jeweiligen Peakflächen der beiden Altersgruppen zueinander ins Verhältnis gesetzt. Dabei kann die relative Stärke der Veränderung , bei denen der Gehalt einer Substanz während des Lagerzeitraums abnimmt, in Prozent direkt durch den Quotienten Peakfläche jung ⋅ 100 Peakfläche alt > 100 (Gl. 11) und für alle "anabolen" Prozesse, bei denen Substanzen während der Lagerzeit entstehen, durch Peakfläche jung ⋅ 100 Peakfläche alt < 100 (Gl. 12). veranschaulicht werden. Da bei sehr kleinen Peaks in der Nähe der Nachweisgrenze große Schwankungen sowohl bei der Integration der Peakfläche als auch bei der Retentionszeit nicht zu vermeiden waren, wurde das Verfahren der Datenaufnahme, Integration, Zuordnung und Verhältnisbildung einmal vollständig wiederholt. Die Ergebnisse aus beiden, unabhängigen Versuchsreihen a und b stellen sich wie folgt dar: - 96 - Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 1a./b. Substanzen, die während der Lagerzeit abnehmen: Abb. 5-20: Relative Abnahme von Substanzen während der Lagerzeit (a) 6000 rel. Abnahme während der Lagerzeit in % 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 5400 5600 Scan-Nummer Abb. 5-21: Relative Abnahme von Substanzen während der Lagerzeit (b, Wdh.) 6000 rel. Abnahme während der Lagerzeit in % 5000 4000 3000 2000 1000 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 5400 SCAN-Nummer 2a./b. Substanzen, die während der Lagerzeit zunehmen: 6000 5000 rel. Zunahme während der Lagerzeit in % Abb. 5-22: Relative Zunahme von Substanzen während der Lagerzeit (a) 4000 3000 2000 1000 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 5400 5600 Scan-Nummer - 97 - Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 6000 Abb. 5-23: Relative Zunahme von Substanzen während der Lagerzeit (b, Wdh) 5500 rel. Zunahme während der Lagerzeit in % 5000 4500 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800 5000 5200 5400 Scan-Nummer Die Wiederholung der Datenaufnahme, Integration und Zuordnung der Peakflächen zwischen den alten und jungen Mustern (Abbildungen 5-21 und 5-23) zeigt kein anderes Ergebnis als der erste Versuch (Abbildungen 5-20 und 522). Daher ist eine Fehlzuordnung der Peaks zwischen den beiden Altersgruppen auszuschließen. Im Ergebnis belegt dieser Datenvergleich, dass die Hauptveränderungen des Untersuchungsmaterials während der Lagerzeit durch die Abnahme leichtest flüchtiger Verbindungen bedingt werden (Abbildungen 5-20 und 5-21). Die größte Gehaltsabnahme erfährt dabei Methylmercaptan mit Scan-Nr. 165. Die Abnahme von Dimethylsulfid (Scan-Nr. 265) und Ethylformiat (Scan-Nr. 427) ist zwar in der ersten Versuchsreihe deutlicher ausgeprägt als in der Wiederholung, sie ist aber grundsätzlich wesentlich geringer als die Veränderung des Gehalts von Methylmercaptan. Weiterhin fällt eine relativ hohe Konstanz der übrigen Peakflächen auf. Den Veränderungen bei Scan-Nr. 3003 und 4190 (Abb. 5-20) konnten im Bibliotheksspektrenvergleich keine ausreichend sicher identifizierten Verbindungen zugewiesen werden. Der Anteil der absoluten Peakfläche des Scans 3003 an der Gesamtpeakfläche lag unter 0,001 %, der des Scans 4190 bei 0,004 %. Da diese Bereiche bei der GCO- und AEVA-Untersuchung nicht bzw. nicht übermäßig unangenehm (sauer, kalt, metallisch) auffällig geworden waren und die Flüchtigkeit der Verbindungen zudem gegen eine Beteiligung am olfaktorischen Fehleindruck sprachen (vgl. Kapitel 5.3.1.2, S. 95), wurden diese Veränderungen nicht weiter untersucht. Die Suche nach den unbekannten, olfaktorisch aktiven Substanzen bei Scan 4197 und 4392 (vgl. Tabelle, S. 95) wurde aufgrund der fehlenden stofflichen Veränderung eingestellt. Alle Veränderungen, die mit der Bildung von Substanzen während der Lagerzeit einhergehen, sind verglichen mit der Abnahme des Methylmercaptangehalts als gering zu bewerten. Nur zweimal konnte ein Anstieg der Peakflächen - 98 - Ergebnisse: Instrumentelle Analytik während der Lagerzeit nachgewiesen werden (vgl. Abb. 5-22 und 5-23). Eine sichere Zuordnung dieser Spektren bei Scan-Nr. 2620 und Scan-Nr. 4270 im Spektrenvergleich gelang nicht. Da beide Substanzen mikro-olfaktorisch nicht auffällig waren, waren keinerlei Hinweise gegeben, die für eine Beteiligung „anaboler“ Prozesse an der Aromaveränderung von P sprachen. Bei den drei aufgrund der Ergebnisse der AEV-Analyse für das Aroma von P verantwortlichen Verbindungen Eugenol, 1,8-Cineol und Linalool konnten keine signifikanten Veränderungen im Gehalt festgestellt werden. Damit ist die Anwendbarkeit der AEVA auf das vorliegende Problem in Frage zu stellen. Die Verursachung des anfänglichen, unangenehmen Geruchseindrucks an P durch die schwefelhaltigen, leichtest flüchtigen Verbindungen muss dagegen als immer wahrscheinlicher angesehen werden. 5.4.3 Stoffliche Veränderungen durch die Filtration über Aktivkohle Wie bereits beschrieben, führt eine Filtration über Aktivkohle zu einer sofortigen Verbesserung des Geruchseindrucks an P. Demnach müssen schon zwischen den beiden Zuständen "filtriert" und "unfiltriert" stoffliche Veränderungen nachzuweisen sein. Die bisherigen Untersuchungen engen den Kreis potentieller Fehlgeruchssubstanzen auf niedermolekulare Schwefelverbindungen ein, obwohl die AEVA 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol neben Ethanol als produktaromaprägend ausgewiesen hatte. Die Auswirkungen einer Filtration über Aktivkohle auf diese Geruchsstoffe zeigen folgende Graphiken. Abb. 5-24: Einfluss der Aktivkohlefiltration auf den Gehalt von Methylmercaptan im Dampfraum über P Einfluss von Aktivkohle auf die Methylmercatankonzentration 1000000 90 900000 80 800000 70 Flächen abs. 700000 unfiltriert filtriert 60 600000 50 500000 40 400000 Abnahme relativ zum unfiltrierten Zustand 30 300000 200000 20 100000 10 0 0 A B C D E F G H I J K L M N O P Chargen Aus Abbildung 5-24 geht hervor, dass die Behandlung mit Aktivkohle den Gehalt an Methylmercaptan im Mittel um ca. 50 % (zwischen 27 bis 85 %) reduziert. - 99 - Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Der Anstieg der absoluten Peakflächen von Charge K an war durch die Einführung der direkten HS-GC-Kopplung im Gegensatz zu der zuvor praktizierten indirekten Kopplung (vgl. Kapitel 5.2.5 und 5.2.6, S. 81 und 82) bedingt. Auf die Konzentration von Dimethylsulfid im Dampfraum über P hat die Filtration über Aktivkohle einen wesentlich geringeren Einfluss als dies bei Methylmercaptan der Fall ist. Flächen abs. Einfluss von Aktivkohle auf die Dimethylsulfidkonzentration 80 5000000 4500000 4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 unfiltriert 60 40 20 filtriert 0 -20 -40 -60 A B C D E F G H I relative Abnahme zum unfiltrierten Zustand J K L M N O P Chargen In etwa zwei Drittel der in Abbildung 5-25 dargestellten Fälle ist beim Vergleich der beiden Zustände "filtriert" und "unfiltriert" der Dimethylsulfidgehalt der mit Aktivkohle behandelten Proben geringfügig höher als der der nicht filtrierten Probe. Nur etwa ein Drittel der Proben weist nach der Filtration einen verringerten Gehalt auf. Es kann festgestellt werden, dass die Aktivkohlefiltration keinen signifikaten Einfluss auf die Verringerung des Gehalts an Dimethylsulfid in P besitzt. Die Steigerung der Nachweisempfindlichkeit des Dimethylsulfids durch die direkte HS-Kopplung ist mit der des Methylmercaptans vergleichbar. Einen Einfluss der Aktivkohlefiltration auf die anderen Aromakomponenten 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol konnte nicht nachgewiesen werden. 5.4.4 Stoffliche Veränderungen durch pH-Wert-Senkung Bei den Verkostungen zu Beginn der Untersuchungen war nach Ansäuerung der Proben eine Verstärkung des Fehlgeruchs bemerkt worden. Die folgende Graphik (Abb. 5-26) stellt daher die Gehalte von Methylmercaptan und Dimethylsulfid im Gasraum über vier verschiedenen Mustern A bis D jeweils mit und ohne Säurezusatz dar. Der pH-Wert nach Ansäuerung lag bei 1, der der nicht behandelten Probe bei 6,5. - 100 - Abb. 5-25: Einfluss der Aktivkohlefiltration auf den Gehalt von Dimethylsulfid im Dampfraum über P Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 350000 90 80 300000 70 250000 Flächen abs. Abb. 5-26: Einfluss von Säurezusatz auf das Verteilungsgleichgewicht von Methylmercaptan und Dimethylsulfid 60 200000 50 150000 mit Säurezusatz ohne Säurezusatz durch Säurezusatz bedingte Erhöhung in % 40 30 100000 20 50000 10 0 0 A B C D Methylmercaptan A B C D Dimethylsulfid Deutlich ist durch den Säurezusatz die Verschiebung des Methylmercaptangleichgewichts auf die Seite der Gasphase zu erkennen. Dagegen hat der Säurezusatz auf die Dampfraumkonzentration des Dimethylsulfids keinen Einfluss. Ein Einfluss des Säurezusatzes auf die anderen Aromakomponenten 1,8Cineol, Linalool und Eugenol konnte mittels HS/GC/MS nicht nachgewiesen werden. 5.4.5 Stoffliche Veränderungen durch Wasserzusatz Um die Geruchsverbesserungen an P nach Wasserzugabe zu untersuchen, wurden gleiche Volumina des Untersuchungsmaterials mit steigenden Volumina Wasser in HS-Vials versetzt. Die sich auf die Analytik nur geringfügig auswirkenden, unterschiedlichen Füllmengen hatten den Vorteil, den Einfluss des Wassers auf konstante Fehlgeruchsmengen zu vergleichen. Bei der HS/GC/MS-Analyse wurden folgende Ergebnisse erzielt: 1 ,4 E+ 0 6 Methylmercaptan 1 ,2 E+ 0 6 D imethylsulfid 1 ,0 E+ 0 6 Fläche abs. Abb. 5-27: Absolute Veränderung der Gasraumzusammensetzung über P nach Wasserzusatz, leichtest flüchtige Fraktion A m e isensäureethylester 8 ,0 E+ 0 5 6 ,0 E+ 0 5 4 ,0 E+ 0 5 2 ,0 E+ 0 5 0 ,0 E+ 0 0 -0 , 5 0 ,5 1 ,5 2 ,5 Verdünnungsfaktor - 101 - 3 ,5 Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 180 M e thylm e rcaptan 160 D imethylsulfid 140 A m e isensäureethylester Fläche rel. 120 Abb. 5-28: Relative Veränderung der Gasraumzusammensetzung über P nach Wasserzusatz, leichtest flüchtige Fraktion 100 80 60 40 20 0 -0,5 0,5 1,5 2,5 3,5 V e rdünnungsfaktor Die Abbildung 5-27 stellt die absoluten Veränderungen der Peakflächen der drei leichtest flüchtigen Komponenten Methylmercaptan, Dimethylsulfid und Ethylformiat dar. In Abbildung 5-28 werden diese durch die relativen Veränderungen, bezogen auf die unverdünnte Probe, noch verdeutlicht. Aufgrund der großen Flächenunterschiede wird das Verhalten der flüchtigen Terpenkohlenwasserstoffe nach Wasserzusatz in der folgenden Graphik gesondert festgehalten. 4,5E+08 a-Pinen 4,0E+08 Camphen Fläche abs. 3,5E+08 ß-Pinen 3,0E+08 Sabinen 2,5E+08 2,0E+08 1,5E+08 1,0E+08 5,0E+07 0,0E+00 -0,5 0,5 1,5 2,5 3,5 Verdünnungsfaktor Die beiden Graphiken (Abb. 5-28 und 5-29) machen deutlich, wie sich das Verteilungsgleichgewicht der Terpenkohlenwasserstoffe, aber auch das des Dimethylsulfids, bei Zusatz von Wasser aus der flüssigen Phase heraus in den Dampfraum verschiebt. Ganz anders verhalten sich Methylmercaptan oder Ameisensäureethylester. Bei beiden Substanzen nehmen der Dampfdruck und damit die Konzentration in der Gasphase nach Wasserzusatz ab (Abb. 5-27, 5-28). - 102 - Abb. 5-29: Absolute Veränderung der Gasraumzusammensetzung über P nach Wasserzusatz, Terpen-Fraktion Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass die Verbindung Dimethylsulfid eine weitaus geringere Rolle beim Zustandekommen des Fehlgeruchs spielen muss als zunächst angenommen wurde. Das beobachtete Verhalten des Fehlgeruchsstoffs Methylmercaptan dagegen steht mit den makro-olfaktorischen Verbesserungen nach Wasserzusatz im Einklang. Das Verhalten von 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol nach Wasserzugabe konnte mit der Headspace-Technik nicht untersucht werden, da sich die drei Substanzen mit dieser im Gasraum über P nicht nachweisen ließen. Aufgrund ihres unpolaren Charakters und ihrer vergleichsweise schlechten Wasserlöslichkeit kann aber angenommen werden, dass sich ihre Verteilungsgleichgewichte analog zu denen der aufgeführten Terpenkohlenwasserstoffe durch die Wasserzugabe verschieben. 5.4.6 Stoffliche Veränderungen bei tiefen Temperaturen Im Laufe der Untersuchungen fiel an Labormustern eine im Vergleich zur tankgelagerten Charge relativ schnelle Verbesserung der olfaktorischen Merkmale auf. Durch Tiefkühllagerung konnte sie verlangsamt werden (vgl. Kapitel 5.1.5, S. 68). Um die Verschiebungen der Aromastoffe bei unterschiedlichen Lagertemperaturen zu studieren, wurden zwei Chargen A und B in je zwei 1l -Glasflaschen gefüllt. Ein Muster wurde bei –21 °C tiefgekühlt (TK), das andere unter Lichtausschluss bei Raumtemperatur (RT) gelagert. In nicht äquidistanten Zeitabständen wurden die beiden tiefgekühlten gegen die bei Raumtemperatur gelagerten Proben verkostet und mittels GC/MS instrumentell-analytisch verglichen. Der direkte Vergleich der absoluten Peakflächen von Methylmercaptan und Dimethylsulfid in der tiefgekühlten und bei Raumtemperatur gelagerten Variante ergibt folgendes Bild: RT = Raumtemperatur TK = Tiefkühlung 450000 Methylmercaptan RT 400000 Methylmercaptan TK 350000 Fläche abs. Abb. 5-30 : Einfluss tiefer Temperaturen auf die Veränderung des Gehalts an Methylmercap-tan und Dimethylsulfid zweier Chargen A und B, absolute Peakflächen Dimethylsulfid RT 300000 Dimethylsulfid TK 250000 200000 150000 100000 50000 Charge A 0 0 20 40 60 80 Lagerzeit in d - 103 - 100 120 Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 400000 Methylmercaptan RT Methylmercaptan TK 300000 Fläche abs. 350000 Dimethylsulfid RT 250000 Dimethylsulfid TK 200000 150000 100000 50000 Charge B 0 50 100 150 Lagerzeit in d Werden die absoluten Veränderungen der Verbindungen über die Lagerzeit betrachtet, so nimmt der Gehalt von Methylmercaptan und Dimethylsulfid bei beiden Chargen A und B ab. Methylmercaptan ist nach etwa 100 Tagen Lagerung bei Raumtemperatur nicht mehr in den Proben nachweisbar, Dimethylsulfid nimmt langsamer ab. Abnahme bei RT in Relation zu TK In den tiefgekühlten Mustern sind in Relation aber stets höhere Gehalte beider Substanzen zu finden. Besonders die Betrachtung der relativen Veränderungen zwischen den bei Raumtemperatur und den tiefgekühlt gelagerten Proben zeigt abermals das unterschiedliche Verhalten von Methylmercaptan und Dimethylsulfid (Abb. 5-31). Methylmercaptan RT 100 Dimethylsulfid RT Methylmercaptan TK 80 Dimethylsulfid TK 60 40 Abb. 5-31: Einfluss tiefer Temperaturen auf die Veränderung des Gehalts an Methylmercaptan und Dimethylsulfid zweier Chargen A und B,relative Veränderungen RT = Raumtemperatur TK = Tiefkühlung 20 Charge A 0 0 20 40 60 80 Lagerzeit in d - 104 - 100 120 Abnahme bei RT in Relation zu TK Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Methylmercaptan RT 100 Dimethylsulfid RT Methylmercaptan TK 80 Dimethylsulfid TK 60 40 20 Charge B 0 50 70 90 110 130 150 170 Lagerzeit in d Hier wird zudem deutlich, dass sich der Gehalt an Methylmercaptan in beiden Chargen bei Raumtemperatur wesentlich schneller verringert als der des Dimethylsulfids. Bei den Untersuchungen wurden auch die Gehalte der drei Inhaltsstoffe 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol verglichen, die aufgrund ihrer hohen Verdünnungsfaktoren bei der Aromaextraktverdünnungsanalyse das Aroma des Untersuchungsmaterials in hohem Maße prägen. Nachfolgend werden in Abbildung 5-32 wie oben bereits geschehen die absoluten Flächen der Substanzpeaks der GC/MS-Analysen über der Lagerzeit aufgetragen und in Abbildung 5-33 die Veränderungen der bei Raumtemperatur gelagerten Probe in Relation zur tiefgekühlten gesetzt. Die absoluten Flächen des Eugenols werden zum einfacheren Vergleich zehnfach verkleinert dargestellt. RT = Raumtemperatur TK = Tiefkühlung 200000000 Eugenol RT (1/10) Eugenol TK (1/10) 160000000 1,8-Cineol RT Fläche abs. Abb. 5-32 : Einfluss tiefer Temperaturen auf die Veränderung des Gehalts an Eugenol, 1,8-Cineol und Linalool zweier Chargen A und B, absolute Peakflächen 1,8-Cineol TK 120000000 Linalool RT 80000000 Linalool TK 40000000 Charge A 0 0 20 40 60 80 Lagerzeit in d - 105 - 100 120 Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 250000000 Eugenol RT (1/10) Eugenol TK (1/10) 1,8-Cineol RT 1,8-Cineol TK 150000000 Linalool RT Linalool TK 100000000 50000000 Charge B 0 50 70 90 110 130 150 170 Abnahme bei RT in Relation zu TK Lagerzeit in d 120 Eugenol RT 110 Eugenol TK 1,8-Cineol RT 100 1,8-Cineol TK 90 Linalool RT 80 Linalool TK 70 60 Charge A 50 0 20 40 60 80 100 120 Lagerzeit in d Abnahme bei RT in Relation zu TK Fläche abs. 200000000 110 Eugenol RT Eugenol TK 100 1,8-Cineol RT 90 1,8-Cineol TK Linalool RT 80 Linalool TK 70 60 Charge B 50 50 70 90 110 130 Lagerzeit in d - 106 - 150 170 Abb. 5-33 : Einfluss tiefer Temperaturen auf die Veränderung des Gehalts an Eugenol, 1,8-Cineol und Linalool zweier Chargen A und B, relative Peakflächen Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Verglichen mit den Abnahmen an Methylmercaptan und Dimethylsulfid während der Lagerung bei Raumtemperatur lassen sich die Gehaltsentwicklungen von 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol bei den bei Raumtemperatur gelagerten Chargen nicht von den tiefgekühlt gelagerten Proben unterscheiden. Die relativen Unterschiede im Vergleich der beiden Lagertemperaturen sind gering, die Peakflächen schwanken im Mittel nur um etwa 10 % während der betrachteten Lagerzeit (Abb. 5-33). Hinweise auf eine relative Ab- oder Zunahme in der bei Raumtemperatur gelagerten Probe, die mit der schnelleren Verbesserung des Geruchs einhergehen konnten, ergaben sich somit für Eugenol, 1,8-Cineol und Linalool erneut nicht. 5.5 Instrumentelle Untersuchung der Destillationsübergänge Die Untersuchung von Destillationsübergängen verfolgte zwei Absichten. Erstens sollte der Konzentrierungseffekt der Fraktionierung die Identifizierung potentieller Geruchsstoffe ermöglichen bzw. erleichtern. Zweitens sollten mögliche Einflussnahmen auf das Fehlgeruchsphänomen über die Steuerung des Destillationsprozesses aufgezeigt werden. Die Temperatur des Destillationsgutes über die Zeit veranschaulicht die folgende Graphik. Bei dieser, eine Produktion begleitenden Untersuchung wurde der Herstellungsprozess viermal durch Temperaturabsenkung unterbrochen. 110 100 Temperatur °C Abb. 5-34 : Temperaturverlauf des Destillationsgutes während der Produktion von P 90 80 70 60 50 40 30 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Destillationszeit in Zeiteinheiten Typische Komponenten aus P werden im Folgenden entweder aufgrund ihrer sensorischen Relevanz oder aufgrund ihres Übergangsverhaltens während der Destillation gruppiert dargestellt. - 107 - Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 1. Übergangsverhalten leichtest flüchtiger Substanzen mit einem Siedepunkt unter 78 °C: rel. Übergangsraten 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Acetaldehyd Ethylformiat Abb. 5-35 : Übergangsverhalten leichtest flüchtiger Substanzen mit einem Siedepunkt unter 78 °C Ethylacetat 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Destillationszeit in Zeiteinheiten Die drei Substanzen Acetaldehyd, Etylformiat und Ethylacetat (Abb. 5-35) zeichnen sich durch hohe Flüchtigkeit aus und zeigen Anreicherungstendenzen in der Gasphase während der Destillationspausen. Sie treten verstärkt in den ersten Fraktionen nach den Pausen auf. Ansonsten kennzeichnen sie relativ konstante, geringe Übergangsraten. rel. Übergangsraten 2. Übergangsverhalten cyclischer Monoterpene: 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 a-Pinen ß-Pinen Camphen a-Terpinen g-Terpinen (+)-3-Caren ß-Myrcen a-Phellandren ß-Phellandren R(+)-Limonen p-Cymen 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Destillationszeit in Zeiteinheiten Diese Gruppe wird durch eine mehr oder weniger stetige Abnahme der von Beginn an hohen Übergangsraten während der ersten Destillationsphase charakterisiert. Nur bei α- und γ-Terpinen ist noch eine Anreicherung in der Gasphase während der ersten Destillationspause zu bemerken. Die Übergangsraten in der zweiten Hälfte der Destillation sind gering. - 108 - Abb. 5-36: Übergangsverhalten cyclischer Monoterpene Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 3. Übergangsverhalten von Substanzen, die wasserdampf-flüchtig sind: 50 Sabinen 45 rel. Übergangsraten Abb. 5-37 : Übergangsverhalten von Substanzen, die wasserdampfflüchtig sind 40 1,8-Cineol 35 Essigsäure 30 Furfuraldehyd 25 a-Copaen 20 Linalool 15 10 5 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Destillationszeit in Zeiteinheiten Die in Abb. 5-37 dargestellte Substanzgruppe zeichnet sich durch wachsende Übergangsraten zu Beginn der Destillation und durch Übergangsmaxima bei sinkenden Alkoholkonzentrationen und steigenden Temperaturen aus. 4. Übergangsverhalten von Sesquiterpenen 50 Abb. 5-38 : Übergangsverhalten von Sesquiterpenen tr. Caryophyllen 45 rel. Übergangsraten 40 a-Humulen 35 Zingiberen 30 Bisabolen 25 ß-Sesquiphellandren 20 15 10 5 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Destillationszeit in Zeiteinheiten Die Substanzgruppe der Sesquiterpene zeigt ebenfalls stetig steigende Übergangsraten in der ersten Hälfte der Destillation. Bei sinkender Alkoholkonzentration und steigender Temperatur des Destillationsgutes steigen diese zum Ende hin nochmals kurz an. Dennoch geht die Hauptmenge jener Gruppe in der ersten Hälfte der Destillation über. Eine Anreicherung der Substanzen in der Gasphase während der Destillationspausen ist nicht zu verzeichnen. - 109 - Ergebnisse: Instrumentelle Analytik 5. Übergangsverhalten von Substanzen mit geringer Flüchtigkeit: 70 Zimtaldehyd Eugenol rel. Übergangsraten 60 Abb. 5-39: Übergangsverhalten von Substanzen mit geringer Flüchtigkeit Isoeugenol 50 Myristicin 40 30 20 10 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Destillationszeit in Zeiteinheiten Diese Gruppe ist durch hohe Übergangsraten in einem relativ engen Zeitfenster bei über 78 °C steigenden Destillationstemperaturen charakterisiert. Die Übergangsraten der Substanzen, die mit dem Zustandekommen des Fehlgeruchs in Verbindung gebracht werden könnten, stellt Abbildung 5-42 dar: 50 H2S rel. Übergangsraten 45 Dimethylsulfid 40 Methylmercaptan 35 30 25 20 15 10 5 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 Destillationszeit in Zeiteinheiten Neben den beiden Verbindungen Methylmercaptan und Dimethylsulfid, die als für den Fehleindruck potentiell verantwortliche Substanzen bisher in Frage zu kommen schienen, gab es bei den Untersuchungen der Destillationsfraktionen erstmals Hinweise auf die Gegenwart von Schwefelwasserstoff mittels HRGC/MS. Der eindeutige Nachweis gelang allerdings erst später mittels HRGC/HRMS (vgl. Kapitel 5.7.2, S. 118). Während Dimethylsulfid hauptsächlich im Vorlauf der Destillation übergeht, was die Eindrücke der sensorischen Untersuchungen der ersten Fraktionen des Destillats unterstützte (vgl. Kapitel 5.1.7, S. 69), fällt bei Betrachtung der - 110 - Abb. 5-40: Übergangsverhalten von Substanzen, die den anfänglichen Fehlgeruch bedingen könnten Ergebnisse: Instrumentelle Analytik Abbildung 5-40 auf, dass Schwefelwasserstoff unerwarteterweise erst etwa zur Halbzeit der ersten Destillationsphase in den Fraktionen nachzuweisen ist. Auch die Übergangsraten des Methylmercaptans beginnen zu diesem Zeitpunkt leicht zu steigen. Bei Substanzen mit einer derart hohen Flüchtigkeit wäre aber ein Übergangsverhalten analog zu dem des Dimethylsulfids oder α-Pinens zu erwarten. Der beobachteten Verlauf kann daher nur durch eine Freisetzung der beiden Verbindungen im Sinne einer Entstehung während der Destillation erklärt werden (vgl. Kapitel 6.4, S. 130). Des Weiteren zeigen die Untersuchungen, dass eine Beeinflussung des Fehlgeruchs durch Herstellungsprozessänderungen nicht möglich ist: Sowohl im Vorlauf als auch im Nachlauf der Destillation gehen wesentliche Komponenten von P über, deren Ausblendung einer Rezepturänderung gleich käme. So wird der Vorlauf durch die Destillation der Monoterpenfraktion, der Nachlauf durch die der Sesquiterpen und phenolischen Verbindungen geprägt. Außerdem scheinen die Übergangsraten der potentiellen Fehlgeruchsstoffe Methylmercaptan und auch die des Schwefelwasserstoffs in der Hauptfraktion des Destillates überzugehen und damit gar nicht separierbar zu sein. 5.6 Methylmercaptan und Dimethylsulfid 5.6.1 Gehaltsbestimmung mittels HS/GC/MS Die Gehaltsbestimmung von Methylmercaptan und Dimethylsulfid in P erfolgte über eine externe Kalibrierung mittels direkt gekoppelter HS/GC/MS. Als Referenzen wurden Methylmercaptan (FLUKA 67733, Lot-Nr. 91809/1 1095) aus einer Niederdruckgasflasche sowie Dimethylsulfid (Merck, Art.-Nr. 8.20833, LOT-Nr. 43900565) in eine tiefgekühlte Vorlage einer sensorisch einwandfreien, mehrere Jahre gelagerten, nachweislich von den beiden Analyten freien, Charge (Matrixcharge) geleitet. Der Gehalt wurde durch Differenzwägung der Standardlösungskolben nach Temperierung ermittelt. Anschließend wurden die so erstellten Standards mit der Matrixcharge verdünnt und mittels HS/GC/MS vermessen. Die Eichgeraden und -funktionen werden in den Abbildungen 5-41 und 5-42 wiedergegeben: - 111 - Methylmercaptan und Dimethylsulfid Abb. 5-41: Eichgerade für Dimethylsulfid in P 600000 m/z 47 + 62 500000 400000 300000 200000 y = 7185,7x - 40735 100000 2 R = 0,9941 0 0 20 40 60 80 100 m/z 47 + 48 Dimethylsulfid in µg/100 ml Abb. 5-42: Eichgerade von Methylmercaptan in P 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0 y = 35208x - 9959,2 2 R = 0,9899 0 1 2 3 M e thylmercaptan in µg/100 m l Die quantitative Untersuchung dieser schwefelhaltigen, flüchtigen Verbindungen in P mittels HS/GC/MS erwies sich trotz der relativ hohen Korrelationskoeffizienten als schwierig und wenig präzise. Aus den Verhältnissen der Peakflächen leichter flüchtigen Verbindungen zahlreicher Untersuchungen junger Chargen ließ sich daher nur ein Gehaltsbereich abschätzen. Danach liegen die Gehalte an Methylmercaptan in jungen, unfiltrierten Proben von P zwischen 10 - 50 µg/l, die an Dimethylsulfid zwischen 200 - 600 µg/l. 5.6.2 Geruchsschwelle von Methylmercaptan Zur Bestimmung der Geruchsschwelle von Methylmercaptan wurde eine Methylmercaptan-Stammlösung mit einer mehrere Jahre alten, sensorisch einwandfreien Matrixcharge P, wie bereits in Kapitel 5.6 bei der Gehaltsbestimmung beschrieben, hergestellt. Mit dieser Stammlösung wurden neun Verkostungsstandards derselben Charge in Verkostungsgläsern mit steigenden Dosen Methylmercaptan versetzt und analog dem Verkostungsverfahren in Kapitel 4.2.4, S. 57, die Geruchsschwelle bestimmt. - 112 - Methylmercaptan und Dimethylsulfid In der folgenden Tabelle sind die Geruchsassoziationen der Testpersonen beschrieben: Glas Gehalt Prüfer 1 Prüfer 2 Prüfer 3 1 0 µg/l gut, normal angenehm gut 2 0 µg/l anders normal gut 3 4,2 µg/l schlecht, kohlig schlecht, kloakig Veränderung 4 10,5 µg/l schlecht, kohlig schlecht, kloakig Veränderung 5 21 µg/l schlecht, kohlig schlecht, kloakig schlecht, kohlig 6 31,5 µg/l schlecht, kohlig schlecht, kaffeeartig schlecht, kohlig 7 42 µg/l schlecht, kohlig kohlig schlecht, kohlig 8 84 µg/l schlecht, kohlig kohlig schlecht, kohlig 9 126 µg/l schlecht, kohlig kohlig schlecht, kohlig Bereits beim ersten Methylmercaptan enthaltenden Standard (Glas Nr. 3) nahmen alle drei Verkoster eine Veränderung wahr, zwei von ihnen beschrieben den Geruch bereits als unangenehm. Die Geruchsschwelle von Methylmercaptan im Untersuchungsmaterial wird damit auf 5 µg/l festgesetzt. Die Erkennungsschwelle liegt offenbar nur knapp über der Geruchsschwelle, da 2 der 3 Verkoster bereits mit dem ersten, Methylmercaptan enthaltenen Standard eine zutreffende Geruchsbeschreibung geben konnten. Die Erkennungsschwelle in P wird bei 10 µg Methylmercaptan/l gesehen. 5.6.3 Geruchsschwelle von Dimethylsulfid Die Versuchsdurchführung erfolgte analog dem Vorgehen der Geruchsschwellenwertbestimmung bei Methylmercaptan im vorherigen Kapitel. Das Ergebnis dieser Versuchsreihe mit fünf Testern stellt sich wie folgt dar: Glas Gehalt Tester 1 Tester 2 Tester 3 Tester 4 Tester 5 1 0 µg/l unauffällig unauffällig gut würzig - 2 20 µg/l normal unauffällig gut würzig - 3 70 µg/l normal unauffällig anders gut - 4 140 µg/l normal unauffällig merkwürdig Veränderung Veränderung 5 170 µg/l Veränderung unauffällig nomal kohlig saure Milch 6 230 µg/l typisch stinkig muffig säuerlich typisch 7 280 µg/l typisch säuerlich, ekelig typisch kaffeeartig typisch 8 430 µg/l typisch, schwer ekelig unangenehm gärig typisch 9 850 µg/l süßlich ekelig unangenehm unangenehm typisch - 113 - Methylmercaptan und Dimethylsulfid Im Bereich von 140 bis 170 µg Dimethylsulfid/l P nahmen jeweils drei der fünf Testpersonen eine deutliche Veränderung zum vorherigen Standard wahr. Die Geruchsschwelle von Dimethylsulfid in P wird daher bei 180 µg/l festgesetzt. Die Erkennungsschwelle des typischen Dimethylsulfidgeruchs liegt ebenfalls nur geringfügig höher und wird mit 230 µg/l angegeben. 5.6.4 Zusammenfassung: Methylmercaptan und Dimethylsulfid und ihre Rolle als Fehlgeruchsstoffe In den bisherigen Untersuchungen wurden aus dem Vielstoffgemisch P 36 Verbindungen als olfaktorisch relevant selektiert, von denen 21 identifiziert werden konnten. 11 dieser Substanzen wurden als angenehm im Geruch empfunden. Von diesen prägen die drei Verbindungen Eugenol, 1,8-Cineol und Linalool zusammen mit Ethanol das Produktaroma. Von den 5 klassischen, in P identifizierten Fehlgeruchssubstanzen fielen vor S S allem die beiden schwefelhaltiH3C H H3C CH3 gen, leichtflüchtigen Verbindungen Methylmercaptan und DiMethylmercaptan Dimethylsulfid methylsulfid auf (Abb. 5-43). Ihr Geruchsbild schien am ehesten mit dem Charakter des zu untersuchenden, anfänglichen Fehleindrucks zu korrelieren. Die Untersuchungen zeigten, dass sich das Verhalten des unangenehm riechenden Methylmercaptans im Gegensatz zu den angenehm riechenden Verbindungen oder Dimethylsulfid in allen untersuchten Punkten mit den makro-olfaktorischen Veränderungen an P in Einklang bringen ließ. So sank die Konzentration der Verbindung in der Gasphase über P während der Lagerzeit, nach Wasserzugabe oder einer Aktivkohlefiltration oder stieg nach Ansäuerung an. Die Abnahme konnte durch Tiefkühlung verzögert werden und die in P nachgewiesenen Konzentrationen lagen über der für Methylmercaptan ermittelten Geruchsschwelle. Dimethylsulfid erfüllte dagen nur zwei der Auswahlkriterien für potentielle Fehlgeruchsstoffe: Der Gehalt nahm während der Lagerzeit nachweislich ab und die Konzentration in P direkt nach der Herstellung lag über der für Dimethylsulfid ermittelten Geruchsschwelle. Das Auftreten der beiden schwefelhaltigen Verbindungen Dimethylsulfid und Methylmercaptan, auch in Gemeinschaft, ist aus lebensmittelchemischer Sicht nicht ungewöhnlich. Beide Substanzen können durch thermischen Abbau schwefelhaltiger Aminosäuren wie Methionin bzw. als Nebenprodukte mikrobiologischer Prozesse entstehen und können praktisch in allen Protein enthaltenden, erhitzten oder längere Zeit gelagerten Lebensmitteln vorkommen - 114 - Abb. 5-43: Strukturformel von Methylmercaptan und Dimethylsulfid Methylmercaptan und Dimethylsulfid (BELITZ und GROSCH, 1992, S. 332). Beide gelten im Allgemeinen als Verursacher von unangenehmen Kocharomen (STEELY, 1994, S.24, CHRISTENSEN und REINECCIUS, 1992, S. 2098) oder als Verderbnisanzeiger. Methylmercaptan wird von OHLOFF (1985, S. 121) in über 40 verschiedenen Aromen identifiziert. MASANETZ, GUTH UND GROSCH (1998, S. 108) machen Methylmercaptan mitverantwortlich für einen fischig, heuartigen Fehlgeruch in getrocknetem Spinat. OHBA und AKIYAMA (1992, S. 473) sehen in Methylmercaptan die Ursache des „Sonnenaromas“ von Sake. CHIN und LINDSAY (1994, S. 90 ff.) führen die Fehlgeruchsbildung bei der Lagerung von Broccoli und anderen Brassica-Arten ebenfalls auf Methylmercaptan zurück. Auch Dimethylsulfid wird in der Literatur häufig als Verursacher von Fehlgeruchseindrücken genannt. NYKÄNEN und SUOMALAINEN (1983, S. 238-240) führen alleine 19 Veröffentlichungen über das Auftreten von Dimethylsulfid in Bier an. Allerdings wird im Zusammenhang mit der sensorischen Relevanz von Dimethylsulfid auch von Hinweisen berichtet, die auf einen möglichen positiven Einfluss dieser Verbindung auf das Aroma deuten. So geben SPEDDING und RAUT (1982, S. 240) an, dass neuseeländische Weine mit Dimethylsulfid in Konzentrationen von 0,022 µg/l solchen vorgezogen werden, die kein oder doppelt soviel Dimethylsulfid enthalten. SHAW und WILSON (1982, S. 685), BERRY et al. (1983, S. 88) und BELITZ und GROSCH (1992, S. 752) weisen Dimethylsulfid im Aroma von Zitrussäften nach. 1971 schloss THORNE et al. (S. 149) einen für das Bieraroma nützlichen Effekt von Dimethylsulfid nicht aus. Vor dem Hintergrund der beschriebenen, nicht eindeutigen Rolle des Dimethylsulfids als Fehlgeruchsstoff und des bei P nachweislich nicht einheitlich mit den makro-olfaktorischen Merkmalen korrelierenden Verhaltens dieser Substanz muss geschlossen werden, der Fehleindruck bei P müsse einzig und alleine durch die Gegenwart von Metylmercaptan bedingt sein. Dies konnte durch den Versuch, eine „Verjüngung“ des Aromas einer gelagerten, sensorisch einwandfreien Probe durch den Zusatz von 10-50 µg/l Methylmercaptan herbeizuführen, allerdings nicht bestätigt werden. Der Geruch einer derart veränderten Probe wich zwar signifikant von dem einer gelagerten Probe ab und wurde auch als unangenehmer, muffiger beschrieben. Er wurde aber nie mit einer gerade produzierten, unfiltrierten Probe verwechselt. Auch die Zugabe entsprechender Mengen Dimethylsulfid bewirkte kein dem zu untersuchenden Fehleindruck kongruent erscheinendes Aroma. Dies änderte sich erst durch die Zugabe geringer Mengen Schwefelwasserstoff zu den „verjüngten“ Mustern. - 115 - Schwefelwasserstoff Das Auftreten dieser sich der Routineanalytik zunächst entziehenden Verbindung in Gesellschaft von Methylmercaptan und Dimethylsulfid ist ebenfalls nicht unbekannt (BELITZ und GROSCH, 1992, 320 ff.). Zudem gab es bei der Quadrupol-MS-Untersuchung der Destillatfraktionen und den GCO-Untersuchungen erste Hinweise auf die Gegenwart dieser Verbindung in P. Obwohl Dimethylsulfid nachweislich keine wesentliche Rolle beim Zustandekommen des Fehlgeruchs spielten, ließ seine Gegenwart schwefelwasserstofffreisetzende Prozesse bei der Herstellung von P erklärbarer erscheinen. 5.7 Schwefelwasserstoff Dass Schwefelwasserstoff am Zustandekommen des anfänglichen Fehleindrucks von P beteiligt sein müsste, basierte auf folgenden Erkenntnissen: 1. Quadrupol-MS-Spektren gaben Hinweise auf Schwefelwasserstoff in Destillationsfraktionen. 2. Bei den GCO-Untersuchungen fiel ein merkwürdig muffiger, nicht zuordenbarer und nicht identifizierbarer Reiz unmittelbar nach dem Injektionspeak auf. 3. Schwefelwasserstoff tritt häufig in Gegenwart von Methylmercaptan und Dimethylsulfid auf (z.B. BELITZ und GROSCH, 1992, S. 320 ff, NYKÄNEN und SUOMALAINEN, 1983, S. 238-240). 4. Schwefelwasserstoff ließ sich im Gasraum einiger tiefgekühlter, junger Proben mittels Gasprüfröhrchen der Firma DRÄGER (Art.-Nr. 8191461, Schwefelwasserstoff 0,2/a) nachweisen. Die Nachweisempfindlichkeit des Gasspürgerätes lag dabei bei 0,2 ppm. Auf der nebenstehenden Abbildung ist auf dem linken Prüfröhrchen deutlich die hellbraune Verfärbung sichtbar (vgl. Marker am Rand, Abb. 5-44), die einen potentiellen Gehalt an Schwefelwasserstoff in der Atmosphäre anzeigt. Das rechte Röhrchen stellt den Blindwert einer sensorisch einwandfreien Charge dar. Eine Querempfindlichkeit gegenüber Methylmercaptan oder Dimethylsulfid konnte bei den DRÄGER-Röhrchen nicht festgestellt werden. An den tielfgekühlten Mustern schien auch ein an - 116 - Abb. 5-44: Nachweis von Schwefelwasserstoff an tiefgekühlten Proben von P mittels DRÄGER-Gasprüfröhrchen Links: positive Probe, Rechts: Blindwert Schwefelwasserstoff Schwefelwasserstoff erinnernder Geruch verstärkt bemerkbar zu sein (vgl. Kapitel 5.1.5, S. 68). Analog zu diesem Versuch konnte der Geruch von P mit Hilfe eines in den Gasraum gehängten Zellstoffbeutels, der mit Bleiacetat gefüllt war, merklich schneller verbessert werden als ohne diese Behandlung (Pb(OAc)2 + H2S Õ PbS↓ + 2 AcOH). Das Bleiacetat färbte sich bei diesem Experiment innerhalb von 3 Tagen ebenfalls merklich hellbraun. Hierbei konnte aber ein Einfluss des Methylmercaptans auf die Verfärbung nicht ausgeschlossen werden, wobei der genaue Reaktionsmechanismus, der zu der ebenfalls hellbraunen Verfärbung führte, nicht erklärt werden konnte. Beim Bleiacetat der DRÄGER-Prüfröhrchen war keine Querempfindlichkeit mit Methylmercaptan aufgefallen. 5. Sensorische Untersuchungen ergaben, dass eine alleinige Dotierung einer gelagerten Probe mit ca. 50 µg/l Methylmercaptan den anfänglichen Fehlgeruch nicht vollständig nachahmen konnte, dass aber die Kongruenz der Geruchszustände bei Zugabe von einer schwefelwasserstoffhaltigen, wässrig-ethanolischen Lösung und einem daraus resultierenden Endgehalt von ca. 25 µg Schwefelwasserstoff/l verbessert werden konnte. Dabei fiel bereits auf, dass Schwefelwasserstoff in einem relativ breiten Konzentrationsbereich direkt über der Reizschwelle nicht den typischen Geruch nach faulen Eiern aufwies, sondern einen dumpfen, leicht süßlichen Geruchseindruck vermittelte. 6. Der objektiv analytische Nachweis von Schwefelwasserstoff im unteren µg/l-Bereich gestaltet sich schwierig. GC/Quadrupol-MS bzw. HS/GC/Quadrupol-MS-Techniken sind aufgrund ihrer geringen Auflösung wenig zur Identifizierung eines solch kleinen Moleküls geeignet. Hinzu kommen zum einen die Schwierigkeiten der chromatographischen Trennung von Gasen, zum anderen die hohe Flüchtigkeit und Reaktivität des Analyten (vgl. MUSSINAN und KEELAN, 1994, S. 3; CHIN und LINDSAY, 1993, S. 835; REINECCIUS, 1985, S. 130). Als eindeutiger Nachweis von Schwefelwasserstoff in P konnten diese Beobachtungen allerdings nicht gewertet werden. Dieser gelang letztendlich mittels Anwendung der hochauflösenden Massenspektroskopie (HRGC/HRMS, vgl. Kapitel 5.7.2, S. 118). 5.7.1 Zur Analytik von Schwefelwasserstoff Die Detektoren der Wahl zur gaschromatographischen Untersuchung von schwefelhaltigen Verbindungen, insbesondere von Schwefelwasserstoff im Spurenbereich, sind schwefelsensitive Detektoren wie der Flammphotometrische Detektor (FPD), der Atomemissionsdetektor (AED), der Chemolumines- 117 - Schwefelwasserstoff zensdetektor oder elektrochemische Detektionssysteme. (z.B. MISTRY, 1994, S. 9-21, SZELEWSKI und HEDRICK, 1997, S. 592-594; GERBERSMANN et al., 1995, S. 93-104; MESTRES, 1997, S. 261-269). Mit einem Quadrupol-Massenspektrometer ist die Identifizierung von Schwefelwasserstoff (M(H2S) = 34 g/mol) im Spurenbereich grundsätzlich schwierig. Ein Grund hierfür ist vor allem der geringe Informationsgehalt des MS-Spektrums aufgrund der wenigen „Fragmentierungsmöglichkeiten“ des kleinen Moleküls (vgl. Anhang II, Massenspektrum von Schwefelwasserstoff). Während der Untersuchungen wurde versucht, den Atomemissionsdetektor (AED) und ein auf Chromsäure basierenden elektrochemischen Detektor (airmoMEDOR, Fa. Airmotec GmbH) zur Bestätigung der Vermutung der Gegenwart von Schwefelwasserstoff in P heranzuziehen. Die Untersuchungen mit dem AED wurden sowohl am Institut für Lebensmittelchemie der TU Berlin als auch am Bundesinstitut für Materialforschung in Berlin durchgeführt. Die Identifizierungsversuche mit Hilfe des elektrochemischen Detektors wurden durch die Firma Airmotec GmbH in Essen vorgenommen. Beide Versuche mit beiden Detektorsystemen mussten allerdings abgebrochen werden, ohne Schwefelwasserstoff sicher nachgewiesen oder ausgeschlossen zu haben, da kein hinreichend geeignetes chromatographisches System zur Trennung der Gasphase über P zur Verfügung stand. 5.7.2 Identifizierung von Schwefelwasserstoff in P mittels HRMS Mit Hilfe der doppeltfokussierenden HRGC/HRMS im Single-Ion-MonitoringModus war es erstmals möglich, den Massepeak 34 des Sauerstoffisotops 18O16O (M: 33,9941 ca. 0,1 % in der Luft) von dem des H S (M: 33,9877) ab2 zutrennen und die Gegenwart von Schwefelwasserstoff in unfiltrierten Mustern bzw. in Destillaten von P eindeutig zu belegen. Die hierfür erforderliche hohe Auflösung A(4) von mindestens 5310 gestattet es, Schwefelwasserstoff auch ohne eine normalerweise notwendige chromatographische Trennung neben den Luftbestandteilen des Injektionspeaks zu identifizieren. Die folgenden Standbilder der detektierten Massen in diesem Bereich kurz vor dem H2S-Peak bzw. während der Elution des H2S-Peaks verdeutlichen den Nachweis: 4 m = 33,9877, ∆m = 0,0064, daraus folgt nach Gl. (10): A muss größer 5310 sein. - 118 - Schwefelwasserstoff Abb. 5-45:: HRMS-Spektrum ohne Schwefelwasserstoff Channel A 16 + Channel B 18 16 O2 , 31,9899 + O O , 33,9941 33,9877 Im oberen, linken Teil der Abbildung 5-45 des simultan aufgezeichneten Massenspektrums wird die Referenzmasse (Channel A: Ref. Mass, Kalibriermasse, hier z.B. 31,9899 von 16O2+) und im unteren Teil (Channel B) die Masse 33,9877 für H2S+ angezeigt. Rechts neben der Masse 33,9877 ist im Blindwert deutlich ein Peak zu erkennen, der aufgrund seiner Intensität und seiner Masse dem Sauerstoffisotop 18O16O (33,9941) zugeordnet werden kann. Die Auflösung betrug 5600. Während der Elution des als Schwefelwasserstoff vermuteten Peaks konnte folgendes Standbild der Massenregistration aufgenommen werden (300 µl Headspace über P, manuell injiziert): Abb. 5-46 : HRMS-Spektrum mit Schwefelwasserstoff Channel A 16 + Channel B H2S , 33,9877 O2 , 31,9899 + 18 16 + O O, 33,9941 Deutlich ist in Abb. 5-46 im Channel B der Peak mit der Masse 33,9877 zu erkennen, der dem Ion H2S+ zugeordnet wurde. Eine Quantifizierung des mittels HRGC/HRMS eindeutig nachgewiesenen Schwefelwasserstoffs gelang bei diesen Versuchen jedoch nicht. Die - 119 - Schwefelwasserstoff Schwankungen waren aufgrund der manuellen Injektion und der Detektion im Spurenbereich zu groß, um verlässliche Aussagen treffen zu können. Eine Schätzung ergab einen Gehalt von Schwefelwasserstoff in P zwischen 10 und 50 µg/l. 5.7.3 Simulation der Freisetzung von schwefelhaltigen Substanzen aus den eingesetzten Drogen im Labor Unter labortechnischen Bedingungen ist es nie gelungen, ein Drogendestillat zu erzeugen, das den Fehlgeruch der großtechnisch hergestellten Chargen unzweifelhaft verstärkt aufwies. Der Geruch der destillativ angereicherten Konzentrate, der als kaffeeartig, hart und dumpf beschrieben wurde, erinnerte nur bedingt an den typischen, unangenehmen Geruch junger Chargen. Hauptgrund hierfür ist in der Diskriminierung der den typischen Produktgeruch von P prägenden Verbindungen Cineol, Linalool und Eugenol bei destillativen Anreicherungen zu sehen (vgl. Kapitel 5.2.1, S. 72). Obwohl die potentiellen Fehlgeruchssubstanzen hohe Flüchtigkeiten aufzuweisen schienen, konnte im Labor trotz erhöhtem Drogeneinsatz und Verwendung effektiver Kühltechniken der zu untersuchende Fehlgeruch nicht überzeugend dargestellt werden. Dies änderte sich auch nicht grundlegend, nachdem die aufgrund der kurzen Destillationszeiten im Labor bedingte, geringe thermische Belastung auf das Drogengut durch die Verlängerung der Maische- und Destillationszeiten, durch Erhöhung des Wasseranteils in der Maische und Einführung von Erhitzungsphasen der Drogen unter Rückfluss erhöht wurde. An solchen Destillaten gelang es aber erstmals, die Freisetzung von Schwefelwasserstoff aus den eingesetzten Drogen mittels HRGC/MS nachzuweisen. Hierbei wurden zunächst die Ausgangsdrogen 5 Tage lang in einem 500 ml Rundkolben in einer 5 Jahre alten Matrixprobe, die im Verhältnis 1:1 mit demineralisiertem Wasser verdünnt worden war, eingemaischt („Vorlauf“). Das Drogen-Lösemittel-Verhältnis überstieg dabei das normaler Produktionsproben um den Faktor 12,5. Pro folgendem Destillationstag wurde der Ansatz 2 Stunden mit Hilfe einer gekühlten 50 cm Vigreux-Kolonne am Rückfluss gekocht, wobei das angeschlossene Destillationsrohr bereits in 2 ml 50 %igen Ethanol in einen mit Eis/Kochsalz-gekühlten Spitzkolben ragte, um möglicherweise übergehende Gase auffangen zu können. Nach 2 Stunden begann die eigentliche Destillationsphase, nachdem die Vigreux-Kolonne nicht mehr gekühlt, sondern mit Aluminumfolie leicht wärmeisoliert worden war. Die Destillationsgeschwindigkeit betrug ca. 25 ml/Stunde. Nach Gewinnung von 25 bis 50 ml Destillat wurde die Heizung abgeschaltet und der Spitzkolben fest verschlossen bei –21 °C bis zur Untersuchung gelagert. Am nächsten Tag wurde die abdestillierte Menge durch Wasser ergänzt und wie beschrieben erneut destilliert. - 120 - Schwefelwasserstoff Die folgende Graphik stellt das Übergangsverhalten der drei schwefelhaltigen Substanzen während der auf drei Tage ausgedehnten Labordestillation dar. Neben den ermittelten, absoluten Peakflächen werden auch die relativen Übergangsraten, bezogen auf die Gesamtsumme der detektierten Peakflächen der jeweiligen Substanz, dargestellt. 1,E+07 S c h w e felw a s s e r s t o f f M e thylm e rcaptan 1,E+07 D im e t h y l s u l f i d Peakflächen (abs.) Abb. 5-47 : Übergangsverhalten schwefelhaltiger Verbindungen während einer mehrtägigen Labordestillation (absolute Peakflächen) 1,E+07 8,E+06 6,E+06 4,E+06 2,E+06 0,E+00 Vorlauf D e s t illa t i o n 2 D e s t illa t i o n 3 Rückstand 80 S c h w e felw a s s e r s t o f f 70 M e thylm e r c a p t a n D imethylsulfid 60 Peakflächen (rel.) Abb. 5-48: Übergangsraten schwefelhaltiger Verbindungen während einer mehrtägigen Labordestillation (relative Peakflächen) D e s t illa t i o n 1 50 40 30 20 10 0 Vorlauf Destillation 1 Destillation 2 Destillation 3 Rückstand Aus den relativen Übergangsraten in Abbildung 5-48 geht besonders deutlich hervor, dass bereits am ersten Destillationstag die Hauptmenge an Dimethylsulfid übergeht, Methylmercaptan dagegen erst am zweiten bzw. Schwefelwasserstoff sogar erst am dritten Tag ihr Übergangsmaximum erreichen. Im Destillationsrückstand konnten nur geringe Mengen an Schwefelverbindungen, die mit denen im Vorlauf vergleichbar waren, nachgewiesen werden, ein Tatbestand, der sich mit dem Untersuchungsbefund des flüssigen Destillationsrückstands aus der großtechnischen Produktion (Schlempe) deckte. - 121 - Schwefelwasserstoff 5.7.4 Stabilität von Schwefelwasserstoff Die Schwierigkeiten bei dem Versuch des Nachweises von Schwefelwasserstoff ließen frühzeitig die Vermutung aufkommen, dass sich Schwefelwasserstoff der Detektion durch physikalische Ursachen oder möglicherweise sogar durch chemisch bedingte Veränderung entzieht. Abbildung 5-49 zeigt die Abnahme von Schwefelwasserstoff in einem im Labor hergestellten Drogendestillat. Aufgetragen sind die mittels GC/MS detektierbaren Peakflächen über der Zeit nach der Destillation bezogen auf den Startwert. Abb. 5- 49: Stabilität von Schwefelwasserstoff in kleinen Volumina 140 Peakfläche (rel.) 120 100 80 60 40 20 0 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 Z e i t n a c h d e r D e s t i l l a t i o n in [ m in ] Aus diesen Untersuchungen konnte auf eine Halbwertszeit für Schwefelwasserstoff in P von nur etwa 9 Stunden geschlossen werden. Da diese rapide Abnahme vor allem an relativ kleinen Volumina von 2 bis 30 ml festgestellt worden war, wurde eine physikalisch bedingte Abnahme der Verbindung durch Ausgasen für wahrscheinlicher gehalten als eine chemische Veränderung. 5.7.5 Korrelation sensorischer Daten mit dem Auftreten von Schwefelwasserstoff Nach der eindeutigen Identifizierung von Schwefelwasserstoff in P mittels HRGC/HRMS musste die Rolle dieser Substanz als potentieller Mitverursacher des Fehlgeruchs verifiziert werden. Hierfür wurden dieselben Einflussgrößen untersucht, die bereits als Bewertungskriterien bei Methylmercaptan und Dimethylsulfid dienten (vgl. Kapitel 5.4.2 bis 5.4.5, S. 96 ff.). 5.7.5.1 Einfluss der Lagerzeit Der Nachweis von Schwefelwasserstoff erfolgte an jungen, unfiltrierten Mustern und an Destillaten dieser Muster. In gelagerten Proben konnte kein - 122 - Schwefelwasserstoff Schwefelwasserstoff nachgewiesen werden. Aufgrund der Datenlage ist davon auszugehen, dass der Gehalt von Schwefelwasserstoff während der Lagerzeit von P abnimmt. 5.7.5.2 Einfluss der Filtration Die Filtration über Aktivkohle hatte auf die Schwefelwasserstoff-Gehaltsabnahme einen deutlich größeren Einfluss als die pH-Wert-Erhöhung oder die Wasserzugabe. Die Reduktion des Gehaltes durch diese Behandlung erfolgte um etwa 80 % des Ausgangswertes der nicht behandelten Probe. 5.7.5.3 Einfluss des pH-Wertes Der pH-Wert hatte nachweislich einen Einfluss auf die Detektierbarkeit von Schwefelwasserstoff in der Gasphase. So führte starkes Ansäuern der Probe zu einer Erhöhung des in der Gasphase detektierbaren Schwefelwasserstoffs. Ähnliches wurde bereits für Methylmercaptan nachgewiesen, ein Verhalten, das sich insgesamt gut mit den olfaktorischen Beobachtungen in Kapitel 5.1.3, S. 65, in Einklang bringen lässt. 5.7.5.4 Einfluss von Wasser Schon eine Erhöhung des Wasseranteils um 30 % (Verdünnungsfaktor 1,1) hatte eine Reduktion des Schwefelwasserstoffgehaltes im Gasraum über der Probe von 50 % zur Folge. Die Annahme der Verschiebung des Gleichgewichtes der relativ polaren Substanz Schwefelwasserstoff aus der Gasphase in die mit Wasser verdünnte flüssige Phase wird damit belegt. 5.7.5.5. Einfluss tiefer Lagertemperaturen Der Einfluss tiefer Lagertemperaturen, dessen Wirkung auf Methylmercaptan und Dimethylsulfid in P bereits dargestellt worden war, konnte für Schwefelwasserstoff aus analytisch-technischen Gründen nicht untersucht werden. Es fiel aber auf, dass an den tiefgekühlten Proben direkt nach Entnahme aus dem Kühlschrank ein an Schwefelwasserstoff erinnernder Geruch wahrnehmbar erschien. Nur an diesen Proben gelang auch der Nachweis mit den Gasprüfröhrchen der Firma DRÄGER (vgl. Kapitel 5.7, S. 116). Damit kann nicht mehr auf eine theoretisch mögliche Verlangsamung der Gehaltsabnahme des Fehlgeruchs Schwefelwasserstoff durch die Tiefkühllagerung geschlossen werden. - 123 - Schwefelwasserstoff Trotzdem korreliert das Verhalten von Schwefelwasserstoff durch äußere Einflüsse mit allen wesentlichen makro-olfaktorischen Merkmalsänderungen von P. Wie beim Methylmercaptan ergeben sich keine Anhaltspunkte, die gegen eine Beteiligung des Schwefelwasserstoffs am anfänglichen Fehlgeruch von P hätten sprechen können, auch wenn seine Rolle beim Zustandekommen desselben kleiner als die des Methylmercaptans sein dürfte. 5.7.6 Gehaltsbestimmung von Schwefelwasserstoff Auch nach der Identifizierung von Schwefelwasserstoff als Fehlgeruchssubstanz war es nicht gelungen, die Abschätzung seines Gehalts mit Hilfe instrumentell-analytischer Verfahren auf aussagekräftigere Daten als zuvor zu stellen, obwohl es gelang, im SIM-Modus auch mit einem Quadrupol-MS in Routine-Proben H2S nachzuweisen und mit sensorischen Daten zu korrelieren. Bei den Versuchen wurde zunächst eine mehrere Jahre alte, sensorisch einwandfreie Probencharge (Matrixcharge) mit Natriumsulfid versetzt. Nach Zugabe von einer nach Na2S + 2 H+ →2 Na+ + H2S↑ berechneten Menge Salzsäure wurde im Untersuchungsmaterial Schwefelwasserstoff generiert, der sich ausgasend geruchlich im Dampfraum über der Lösung bemerkbar machte. Der Sulfidgehalt der Stammlösung wurde anschließend durch eine iodometrische Titration bestätigt (JANDER, JAHR und KNOLL, 1973, S. 104-105). Aus dieser Stammlösung wurden durch Verdünnung mit der Matrixcharge Eichstandards hergestellt, wobei der hohen Flüchtigkeit des Analyten durch entsprechende Maßnahmen wie schnelles, direktes Einleiten der Stammlösung in gekühlte Vorlagen u.ä. Rechnung getragen wurde. Dennoch sind alle Versuche, eine lineare Eichfunktion für Schwefelwasserstoff im unteren µg/l-Bereich mittels HS-Analyse aufzustellen, fehlgeschlagen. Auch durch Anwendung nasschemischer, photometrischer Verfahren nach ACREE (1971, S. 110) oder GUSTAFFSON (1959, S. 227), bei denen Schwefelwasserstoff nach Umsetzung mit 4-Amino-N,N-dimethylanilin in Gegenwart von Eisen(III)-Ionen zu Methylenblau photometrisch bestimmt werden sollte, konnten keine weiteren quantitativen Daten gewonnen werden. - 124 - Schwefelwasserstoff Die hierbei praktizierte Anreicherungstechnik, den ausgetriebenen Schwefelwasserstoff direkt durch Einleiten in Cadmiumhydroxid- oder Zinkacetatlösungen abzufangen (Abb. 5-50), war Abb. 5-50 : erfolglos. Die Überprüfung der in Anordnung zur Purgeund Trapder Literatur angegebenen NachAnreicherung von weis- und Bestimmungsgrenzen Schwefelwasserstoff, modifiziert nach von unter 1 ppb SchwefelwasACREE (1971) serstoff in Wasser gelang an P nicht. Eine Erklärung für eine Erhöhung dieser Grenzen durch etwaige Störungen der Reaktion konnte nicht gefunden werden. Die Umsetzung von zugesetztem Sulfid zu Methylenblau direkt in P war qualitativ nicht beeinträchtigt wie der Vergleich der UV-VISSpektren in Abb. 5-51 und 5-52 zeigt, so dass die ungewöhnlich hohen Alkoholkonzentrationen keine chemische Störung des Nachweises darstellen: Abb. 5-51: UV/VIS-Spektrum des Sulfidnachweises als Methylenblau nach ACREE (1971) in P Abb. 5-52: UV/VIS-Spektrum der Referenzsubstanz Methylenblau, Reagenzienblindwert in P - 125 - Schwefelwasserstoff Auch die Daten der HS/GC/MS-Untersuchungen im SIM-Modus waren zu wenig reproduzierbar, um aussagekräftig zu sein und genauere Angaben über die Schwefelwasserstoffkonzentration in jungen Chargen von P zu liefern. Aufgrund der beschriebenen Schwierigkeiten muss die zuvor gemachte Abschätzung des Gehaltes von 10 bis 50 µg Schwefelwasserstoff/l in P aufrecht erhalten werden. 5.7.7 Geruchsschwelle von Schwefelwasserstoff Um die Geruchsschwelle von Schwefelwasserstoff in P zu bestimmen, wurde analog dem Verfahren vorgegangen, das unter Kapitel 5.6.2, S. 112, für Methylmercaptan beschrieben wurde. Als Referenz diente eine entsprechend angesäuerte Natriumsulfid-Lösung bekannten Gehalts in einer Matrixcharge von P. Die beim Abriechen der Verkostungsstandards nach steigenden Gehalten wahrgenommenen Geruchsempfindungen stellen sich wie folgt dar: Nr. Gehalt Prüfer 1 Prüfer 2 Prüfer 3 Prüfer 4 Prüfer 5 0 0 µg/l sprittig, normal gut leicht stechend, erdig gut gut, angenehm fruchtig 1 0 µg/l sprittig, normal gut gut gut, scharf gut, angenehm fruchtig 2 4 µg/l süßlich, nicht unangenehm Abweichung dumpf, abweichend gut leicht stechend 3 8 µg/l süßlich, nicht unangenehm dumpf, hart dumpf, kohlig, abweichend kloakig leicht muffig 4 13 µg/l süß, nicht unangenehm dumpf, etwas runder dumpf, kohlig, abweichend, faulig kloakig stärker muffig 5 17 µg/l süß, unangenehm muffig dumpf, kohlig, abweichend, faulig dumpf muffig 6 21 µg/l süß, unangenehm nach faulen Eiern dumpf, kohlig, abweichend, faulig dumpf stechend 7 26 µg/l unangenehm, nach faulen Eiern nach faulen Eiern schwefelig schlecht, muffig stechend 8 30 µg/l unangenehmer als vorher, n. faulen Eiern nach faulen Eiern brenzlig schlecht, muffig erdig 9 34 µg/l unangenehmer als vorher, n. faulen Eier nach faulen Eiern dumpf schlecht, n. faulen Eiern erdig, faulig - 126 - Schwefelwasserstoff Vier der fünf Verkoster nahmen bereits bei der ersten Dosierung von 4 µg/l eine geruchliche Veränderung an P wahr. Bereits bei der nächsthöheren Stufe von 8 µg/l registrierten alle Verkoster eine Geruchsabweichung. Die Geruchsschwelle von Schwefelwasserstoff im Untersuchungsmaterial wird unter den gegebenen Versuchsbedingungen auf 5 µg/l festgelegt. Die Erkennungsschwelle des typischen Geruchs nach faulen Eiern liegt in P dagegen erst bei etwa 25-30 µg/l. In dem Bereich zwischen Geruchs- und Erkennungsschwelle vermittelt Schwefelwasserstoff einen eher dumpfen, süßlichen und muffigen Geruchseindruck. 5.7.8 Schwefelwasserstoff als Fehlgeruchssubstanz Schwefelwasserstoff zählt zu den „character impact compounds“ und ist eine typische, weitverbreitete Fehlgeruchssubstanz, die häufig als thermisches Abbauprodukt in eiweißreichen Lebensmitteln oder als Nebenprodukt von mikrobiologischen Prozessen auftritt. So kann er z.B. beim Erhitzen von eiweißreichen Lebensmitteln wie Kuhmilch (STEELY, 1994, S. 22 ff.) oder Sojamilch (LUTTRELL et al., 1981, S. 373) durch Zersetzung schwefelhaltiger Aminosäuren entstehen oder zum Aroma von Bier (z.B. THORNE et. al, 1971, S. 148-149, NARZIß et al., 1985, S. 439 ff.), Wein (z.B. LEMPERLE, 1981, S. 129 ff.; RAUHUT, 1993, S. 214/215) oder Spirituosen (z.B. NEDJEMA und MAUJEAN, 1994, S. 495-502, MASUDA und NISHIMURA, 1981, S. 101) beitragen. Er ist wie Dimethylsulfid auch am Aroma von Citrussäften (BERRY, 1983, S. 88 ff.; BELITZ und GROSCH, 1992, S. 752) oder von Kohlgemüsen (z.B. MAGA, 1976, S. 149) beteiligt. Hinweise auf oder Erklärungen für das Auftreten von Schwefelwasserstoff oder Methylmercaptan in P bzw. den verwendeten Heilkräutern konnten bei der Literaturauswertung nicht gefunden werden. Daher wurden Untersuchungen zur Genese der beiden Fehlgeruchsstoffe aus dem eingesetzten Drogenmaterial durchgeführt. - 127 - Untersuchung zur Herkunft und Entstehung der Fehlgeruchsstoffe 6. Herkunft und Genese der Fehlgeruchsstoffe 6.1 Zur Rolle des Schwefels im Pflanzenreich Schwefel wird von Pflanzen in Form des anorganischen Sulfat-Ions aufgenommen und zum Aufbau körpereigener Verbindungen zunächst reduziert. Orte dieser reduktiven Sulfatassimilation sind vor allem die Chloroplasten der Blätter bzw. der grünen Gewebe der Pflanze (RICHTER, 1996, S. 145-146). Die Sulfatreduktion gliedert sich in zwei Reaktionsschritte: 1.) die Reduktion von aktiviertem Sulfat (Oxidationsstufe +VI) zu Sulfit (Thiosulfonat, Oxidationsstufe + V) und 2.) die Reduktion des Sulfits zu Sulfid (S2-, Oxidationsstufe formal - I). Durch den Transfer der dabei entstehenden Mercapto-Gruppe auf O-Acetylserin mit Hilfe der O-Acetyl-L-Serin-Sulfhydrylase (= CysteinSynthase) entsteht die Aminosäure L-Cystein. Durch diese Umsetzung wird Schwefel der Sulfid-Stufe erstmals in eine organische Verbindung eingebaut (RICHTER, 1996, S. 148). Aus Cystein und O-Succinylhomoserin kann über die Stufen Cystathionin und Homocystein mit anschließender Methylierung die Aminosäure Methionin dargestellt werden. Die Aminosäuren L-Cystein und L-Methionin zählen neben den Verbindungen Cystin, Homocystein und S-Methylmethionin, die frei oder in Form von Peptiden (z.B. Glutathion) oder Proteinen in Geweben vorliegen, zu den wichtigsten Schwefelverbindungen des Primärstoffwechsels der Pflanzen. Weitere, mengenmäßig aber unbedeutende, schwefelhaltige Verbindungen sind Substanzen wie Thiamin, Liponsäure oder Biotin (RICHTER, 1996, S. 146; BÄRWALD, 1971, S. 130). Aufgrund der bisherigen Erkenntnisse müssen sich die beiden selektierten schwefelhaltigen Fehlgeruchsstoffe Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan aus dem Drogenmaterial und damit aus dessen Pool schwefelhaltiger Verbindung ableiten und generieren lassen. Die inhomogene Verteilung des Schwefels in den Geweben von Samen, Blättern, Rinden oder Wurzeln der Pflanze, sowohl in der anorganischen als auch in der organischen Form, macht es aber bereits im Vorfeld dieser Untersuchungen unmöglich, detaillierte Angaben über den Schwefelgehalt der eingesetzten Drogenmischung zu machen. Die experimentelle Bestimmung des Gesamtschwefelgehalts der Drogenmischung wird daher in Kapitel 6.3, S. 129, beschrieben. Auch Daten über den Proteingehalt oder gar die Aminosäurezusammensetzung von Heilpflanzen sind in der Literatur kaum gegeben. Bei nur knapp der Hälfte der eingesetzten Drogen konnte anhand von Vergleichen mit Gewürzen der Proteingehalt abgeschätzt werden. Nach FARRELL (1985, Part II) liegt dieser bei durchschnittlich 3,9 bis 11,0 %. Angaben über den Cystein- oder Methioningehalt der verwendeten Einzeldrogen, die die wahrscheinlichste Quelle der beiden Fehlgeruchsstoffe darstellten, konnten nicht gefunden werden und wurden daher experimentell bestimmt. - 128 - Untersuchung zur Herkunft und Entstehung der Fehlgeruchsstoffe 6.2 Nachweis und Bestimmung von L-Cystein und L-Methionin im Drogenmaterial Mit Unterstützung der Firma Dr. Ing. Herbert KNAUER GmbH wurde an einer Ausgangsdrogenmischung exemplarisch eine Gehaltsbestimmung von L-Methionin und L-Cystein durchgeführt. Hierbei wurden nach Extraktion der pulverisierten Drogenmischung (Siebfraktion <0,315 mm) mit 60 %igem Methanol die freien Aminosäuren mit Orthophthaldialdehyd-Reagenz derivatisiert und nach Trennung mittels GradientenHPLC (Methanol/0,05 M Na-Acetat-Puffer, pH-7,0) auf einer Spherimage® 80– Säule (300 mm x 4 mm, 5 µm) mittels Fluoreszenzdetektion (SHIMADZU RF 10AxL) bei 330/450 nm (EM/EX) bestimmt. Dabei wurden 60 µmol freies LMethionin/kg Drogenmischung gefunden. Der Nachweis und die Bestimmung von freiem L-Cystein erfolgte nach Oxidation mit Perameisensäure als Cysteinsäure ebenfalls mittels HPLC/ Fluoreszenzanalyse und ergab einen Gehalt von 13 µmol Cystein/kg. 6.3 Bestimmung des Gesamtschwefelgehaltes in den Drogen Da die Aminosäurebestimmung nur den Anteil an freiem, nicht aber den gebundenen Anteil an Cystein und Methionin berücksichtigt hatte, wurde der Gesamtschwefelgehalt mit Hilfe einer Elementaranalyse bestimmt, um eine weitere Aussage über die Gegenwart potentieller Vorstufen von Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan zu gewinnen. Die Untersuchungen erfolgten mit einem VARIO EL der Firma „elementar Analysensysteme GmbH", Hanau, am Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin. Hierbei wurden etwa 2 – 3 mg getrocknete, homogenisierte Drogenmischung durch Hochtemperaturaufschluss bei 1150 °C im Sauerstoffstrom verbrannt und die entstehenden Reaktionsprodukte Schwefeldioxid und Schwefeltrioxid katalytisch zu SO2 reduziert. Dieses wurde dann nach Gastrennung und Reinigung von anderen Verbindungen wie Stickstoff, Wasser oder Kohlendioxid mit einem Wärmeleitfähigkeitsdetektor detektiert. Analysenparameter Proben getrocknete Drogenmischungen, pulverisiert Einwaage 2-3 mg Gerät VARIO EL (elementar Analysensysteme GmbH) Sauerstoff mind. 99,995 % Reinheit Helium (WLD) mind. 99,996 % Reinheit Betriebsart C, H, N, S Nachweisgrenze Schwefel 0,001 mg Schwefel (absolut) - 129 - Untersuchung zur Herkunft und Entstehung der Fehlgeruchsstoffe An fünf verschiedenen Drogenchargen wurde dabei ein Gesamtschwefelgehalt von durchschnittlich 0,9 g/100g (etwa 280 mmol S/kg) festgestellt. Die Standardabweichung lag dabei nur bei knapp 10 %. Damit konnte gezeigt werden, dass wesentlich mehr schwefelhaltige Verbindungen in den Drogen vorliegen, als bisher durch die exemplarische Bestimmung der freien Anteile an L-Cystein und L-Methionin nachweisbar waren. Das Auftreten weiteren L-Cysteins und L-Methionins in dem großen, bisher nicht näher charakterisierten Anteil von Schwefelverbindungen in P ist wahrscheinlich. 6.4 Zur Genese von Methylmercaptan und Schwefelwasserstoff Niedermolekulare Schwefelverbindungen wie Schwefelwasserstoff oder Methylmercaptan sind bekannte Produkte sowohl mikrobiologischer als auch thermisch bedingter Abbaureaktionen (vgl. VAN HAECHT und DUFOUR, 1995, S. 55/60; NYKÄNEN und SUOMALAINEN, 1983, S. 238-240; LAWRENCE und COLE, 1968, S. 99). Da fermentative Prozesse bei der Herstellung bzw. Lagerung von P ausgeschlossen werden können, liegt die Vermutung nahe, das verzögerte Auftreten von Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan (vgl. Kapitel 5.5, S. 107 und 5.7.3, S. 120) könnten durch thermischen Abbau der beiden Aminosäuren L-Cystein und L-Methionin erklärt werden. (vgl. BUCKHOLZ, 1989, S. 413; MARTIN, 1988, S. 20; KOBAYASI und FUJIMAKI, 1965, S. 698; BELITZ und GROSCH, 1992, S. 245; HUNT, 1985, S. 392-393; ARROYO und LILLARD, 1970, S. 769-770). Ein möglicher Reaktionsweg der Freisetzung von Schwefelwasserstoff aus L-Cystein ist der großen Gruppe an Reaktionen zuzuordnen, die als MAILLARD-Reaktionen bei der Entstehung thermischer Aromen in Nahrungsmitteln eine zentrale Rolle spielen. Voraussetzung ist hierbei allerdings das Vorliegen einer α-Dicarbonylverbindung, die den Abbau der freien Aminosäure katalysiert, deren Vorkommen im Drogenmaterial aber als gegeben angenommen werden kann. - 130 - Untersuchung zur Herkunft und Entstehung der Fehlgeruchsstoffe Abb. 6-1 : Freisetzung von Schwefelwasserstoff aus L-Cystein (aus Belitz/Grosch, S. 322) HO R2 R2 O O O + O H2N + C2H5OH O NH 3 R1 R1 CH 2 HS L-Cystein NH 2 H2 C O H H2C N N N R2 R2 R2 R1 CO2 R1 H2O HS O HS R1 O O O H H2S Schwefelwasserstoff Ein weiterer Weg der Schwefelwasserstofffreisetzung aus Cystein kann durch eine ß-Eliminierung erfolgen. Abb. 6-2 : Freisetzung von Schwefelwasserstoff aus L-Cystein durch ß-Eliminierung Base - B H N H R1 O H N O O R2 R1 H2S SH O R2 CH2 Schwefelwasserstoff Cystein, frei oder gebunden Dehydroalanin Im Alkalischen ist dieser Reaktionsmechanismus am wahrscheinlichsten und liefert sowohl aus gebundenem wie freiem Cystein unter Bildung von Dehydroalanin Schwefelwasserstoff. Im Sauren wird der Mechanismus durch die Protonierung der Base B unterdrückt. - 131 - Untersuchung zur Herkunft und Entstehung der Fehlgeruchsstoffe Analog zu Abb. 6-1 kann aus L-Methionin nach STRECKER-Abbaus Methylmercaptan abgespalten werden: Durchlauf des HO O H2N Abb. 6-3 : Freisetzung von Methylmercaptan aus L-Methionin (aus Belitz/Grosch, S. 322) O Strecker-Abbau CH 2 S S L-Methionin + O CH3SH Methylmercaptan Bekanntermaßen laufen diese Reaktionen vor allem bei erhöhten Temperaturen z.B. beim Braten oder Rösten von Lebensmitteln ab. In der Literatur werden im Zusammenhang des Themenkomplexes "MAILLARD-Reaktionen“ und „thermisch erzeugte Aromen" hierzu zahlreiche Modelluntersuchungen beschrieben. Dabei fällt auf, dass diese häufig unter recht drastischen Bedingungen durchgeführt werden, d.h. bei Temperaturen bis zu z.B. 220 °C, bei hohen Drücken und hohen Stoffumsatzmengen an Aminosäuren und Kohlenhydraten (vgl. MARTIN, 1988, S. 4; BUCKHOLZ, 1989, S. 413, MEVISSEN, 1986, S. 9-10 bzw. 160-161). Abbauprodukte wie Schwefelwasserstoff oder Methylmercaptan werden dabei nur selten direkt genannt. Ihr Auftreten wird meist als Intermediärstufen vorausgesetzt bzw. im Zusammenhang mit der Bildung zahlreicher Maillard-Folgeprodukte diskutiert (vgl. z.B. TRESSL et al., 1994, S. 226-227). Inwieweit sie auch unter der Herstellungstemperatur Ps von „nur“ 80 °C und in Gegenwart der hohen Ethanolkonzentrationen ablaufen, sollen folgende Versuche belegen. 6.3 Thermische Abbaureaktionen von L-Cystein und L-Methionin Nachdem die Aminosäuren L-Cystein und L-Methionin in den Ausgangsdrogen nachgewiesen worden sind, wird untersucht, ob die Genese und Freiset- - 132 - Untersuchung zur Herkunft und Entstehung der Fehlgeruchsstoffe zung der Fehlgeruchsstoffe Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan aus diesen Verbindungen unter den Herstellungsbedingungen von P erfolgen kann. Deshalb werden Modellreaktionen mit den beiden freien Aminosäuren durchgeführt und das Auftreten von niedermolekularen, schwefelhaltigen Verbindungen in Gegenwart hoher Alkoholkonzentrationen mit und ohne Drogenzusatz in einem Temperaturbereich von 78 °- 80 °C bei verschiedenen pH-Werten und unterschiedlich langen Erhitzungszeiten untersucht. Zur Ermittlung des Einflusses des pH-Wertes und der Erhitzungsdauer wurden alkoholische Lösungen der beiden L-Aminosäuren Cystein (Merck, Art. 102838) und Methionin (Merck, Art. 105707) mit Phosphorsäure auf pH 5.7, 4.0 und 1.3 eingestellt und unterschiedlich langen Erhitzungsphasen ausgesetzt. Die Konzentration der Aminosäuren in 50 %(v/v) Ethanol betrug ca. 50 mmol/l. Die absolute Menge im Reaktionsansatz lag bei etwa 200 µmol pro Aminosäure bzw. in Gegenwart der Drogenmischung bei 40 mmol AS/kg Drogenmischung. Während aus den eingemaischten Drogen bei der HS/GC keine nennenswerte Mengen an Schwefelverbindungen generiert werden konnten, führte die Erhitzung der Aminosäuren zu einer sicher nachzuweisenden Freisetzung von Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan. Die Ergebnisse der HS/GC/MS-Untersuchungen stellen sich wie folgt dar: Abbauprodukte aus Cystein 90000000 H2S 80000000 70000000 CH3SH CH3SCH3 abs. Peakflächen Abb. 6-4 : Freisetzung von Schwefelwasserstoff, Methylmercaptan und Dimethylsulfid aus Cystein in Abhängigkeit des pH-Wertes und der Erhitzungsdauer 60000000 50000000 40000000 30000000 20000000 10000000 0 Erhitzungsdauer in h bei 80°C pH im Reaktionsansatz 0, pH 1,3 24, pH 1,3 48, pH 1,3 72, pH 1,3 0, pH 4,0 24, pH 4,0 48, pH 4,0 72, pH 4,0 0, pH 5,7 24, pH 5,7 48, pH 5,7 72, pH 5,7 Der thermische Abbau von L-Cystein (Abb. 6-4) bringt nach 24-stündiger Erhitzungsphase bei 80 °C von den drei untersuchten Substanzen ausschließlich Schwefelwasserstoff hervor. Das Maximum wird vom pH-Wert unabhängig nach 24 Stunden erreicht, um dann wieder abzunehmen. Eine plausible Erklärung hierfür kann nicht gegeben werden. Da in Gegenwart von Drogenmaterial sich die nachzuweisende Menge an Schwefelwasserstoff verringert, könnte die ableitbare hohe Reaktivität der Verbindung in Zusammenhang mit der Ab- 133 - Untersuchung zur Herkunft und Entstehung der Fehlgeruchsstoffe nahme während längeren Erhitzungsphasen gebracht werden. Methylmercaptan oder Dimethylsulfid werden ebenso wie Ethanthiol, ein mögliches Reaktionsprodukt des Schwefelwasserstoffs mit Ethanol, nicht nachgewiesen. Da die Nachweisempfindlichkeit von Schwefelwasserstoff bei der HS-Analyse im sauren Milieu steigt, sind Tendenzen zu erkennen, dass der Cysteinabbau im Sauren schwächer abläuft als im Neutralen. Die folgende Abbildung 6-5 stellt die Ergebnisse der Untersuchung an Methionin dar. Abb. 6-5 : Freisetzung von Schwefelwasserstoff, Methylmercaptan und Dimethylsulfid aus Methionin in Abhängigkeit des pH-Wertes und der Erhitzungsdauer Abbauprodukte aus Methionin 2000000 H2S 1800000 1600000 CH3SCH3 abs. Peakflächen CH3SH 1400000 1200000 1000000 800000 600000 400000 200000 0 Erhitzungsdauer in h bei 80°C pH im Reaktionsansatz 0 , pH 1,3 24, pH 1,3 48, pH 1,3 72, pH 1,3 0, pH 4,0 24, pH 4,0 48, pH 4,0 72, pH 4,0 0, pH 5,7 24, pH 5,7 48, pH 5,7 72, pH 5,7 Beim Methionin setzte der Abbau verzögert ein, und lief viel schwächer und deutlich stärker vom pH-Wert und der Erhitzungszeit abhängig ab als dies beim Cystein beobachtet werden konnte. Im Sauren lassen sich vor allem geringe Mengen Schwefelwasserstoff nachweisen, Methylmercaptan dagegen kaum. Nach 48 h übersteigt bei pH 4.0 die Menge an Methylmercaptan erstmals die des Schwefelwasserstoffs. Bei pH 5.7 bzw. nach 72 h Erhitzungsdauer beherrscht die Freisetzung von Methylmercaptan aus Methionin den Abbau der Aminosäure. Dimethylsulfid ließ sich erneut nicht nennenswert nachweisen. Die Gegenwart des Pflanzenmaterial war für die Freisetzungsreaktionen nicht zwingen erforderlich, die Wirkung zudem nicht einheitlich. Während beim Abbau des Methionins eine Unterstützung der Methylmercaptanbildung erkennbar war, nahm die nachweisbare Menge von Schwefelwasserstoff in Gegenwart der Drogen ab, was auf die hohe Reaktivität der Verbindung schließen lässt. Grundsätzlich konnte aber gezeigt werden, dass unter den Herstellungsbedingungen von P aus der freien Aminosäure Methionin vor allem Methylmercaptan und aus Cystein vor allem Schwefelwasserstoff freigesetzt wird. Da beide Aminosäuren im Drogenmaterial nachgewiesen wurden, kann die Genese der beiden identifizierten Fehlgeruchsstoffe aus ihnen plausibel erklärt werden. - 134 - Verfahren zur Schnellreifung von P 7. Verfahren zur Schnellreifung von P Ein Teilziel der vorliegenden Arbeit bestand in der Entwicklung eines Verfahrens, den unangenehmen Geruchseindruck bei Wahrung der Produktqualität unter Verkürzung der Lagerzeiten zu verbessern. Da die Untersuchungen zeigten, dass an dem anfänglich beobachteten Fehlgeruchseindruck die beiden Schwefelverbindungen Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan maßgeblich beteiligt sind und deren Entstehung durch technische Veränderungen am Herstellungsprozess auf keinen Fall zu vermeiden ist, müssen diese Verbindungen selektiv bei der Herstellung bzw. aus dem Vielstoffgemisch P eliminiert werden. Eine aus der Destillationspraxis bekannte Maßnahme gegen aliphatische Schwefelverbindungen ist die Kontaktkatalyse mit Metallen wie Kupfer, Silber Eisen, Zink, Nickel oder Blei (SINCLAIR et. al., 1970, S. 431; WÜSTENFELD und HAESELER, 1964, S. 370). Aus ökonomischen, aber auch aus toxikologischen Gründen wurde P für Verkostungsproben mit pulverisiertem Kupfer (Merck Art. 102703), Zink (Merck Art. 108774) oder Eisen (Merck Art. 103815) versetzt. Die Einsatzmenge betrug 0,1 %(m/v). Die in Gegenwart von Kupferpulver einsetzende makro-olfaktorische Verbesserung war sofort wahrzunehmen und führte zu einem einwandfreien, überzeugenden sensorischen Ergebnis. Diese Verbesserung war auch in Relation zur über Aktivkohle filtrierten Variante wahrzunehmen. Die Einwirkungen von Eisen- und Zink-Pulver waren nicht von der gleichen olfaktorischen Relevanz und wurden daher nicht weiter untersucht. Nach Kupferzusatz war im Gasraum über P kein Methylmercaptan mehr nachzuweisen. Der sensorisch eindrucksvolle Einfluss pulverisierten Kupfers wirkte sich allerdings nicht im gleichen Maße auf die Reduzierung von Schwefelwasserstoff aus. Der Gehalt an Schwefelwasserstoff nach Kupferzusatz fiel nur etwa um den Faktor 2 bis 3, wie die folgende Abbildung 7-1 verdeutlicht: Relative Veränderungen im Dampfraum über P nach Kupferzusatz 120 Methylmercaptan Dimethylsulfid 100 relative Veränderung Abb. 7-1: Einfluss von Kupfer in P auf die Gasraumzusammensetzung: Beeinflussung von Schwefelwasserstoff, Methylmercaptan und Dimethylsulfid Schwefelwasserstoff 80 60 40 20 0 0 100 200 300 Kupferpulver in mg/100ml - 135 - 400 500 Verfahren zur Schnellreifung von P Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass der Anteil des Methylmercaptans am Fehlgeruch den des Schwefelwasserstoffs überwiegt. Eine Beeinflussung des Dimethylsulfidgehalts im Dampfraum konnte erneut nicht nachgewiesen werden. Um den Einfluss von Kupfer auf andere Inhaltsstoffe von P zu überprüfen, wurde P über ein Kupferbett in einer Chromatographiesäule geleitet. Hierbei wurden zunächst 250 mg Kupferpulver (Merck Art. 102703) mit Seesand verrieben und in die Säule zu einer etwa 5 mm starken Schicht (Durchmesser 18 mm) gefüllt. Diese wurde mit 3 x 50 ml unfiltriertem Untersuchungsmuster übergossen und anschließend mittels eines HOWORKA-Ball-Überdrucks innerhalb von 30 Minuten durch die Kupfer-Sand-Schicht gepresst. Dabei verfärbte sich das Kupferpulver von Rot nach Braun/Rot/Grau. Der Vergleich der HRGC/MS-Daten vor und nach dieser Behandlung mit Kupfer ergab bis auf die Abnahme der beiden schwefelhaltigen Verbindungen Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan keine signifikanten Veränderungen anderer Inhaltsstoffe in P. Dimethylsulfid zeigte im Neutralen keine Reaktion auf den Kupferzusatz. Erst im Sauren bei pH 1 wurde es wie Methylmercaptan vollständig abgebaut. Um einen Übergang von Kupfer während des direkten Kontakts mit P und damit eine potentielle Belastung des Produktes ausschließen zu können, wurden Kupfer-Gehaltsmessungen mit Hilfe eines Atomabsorptionsspektrometers (AAS) am Bundesinstitut für gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinärmedizin durchgeführt. Die Analysenparameter der Untersuchung fasst folgende Tabelle zusammen: Analysenparameter AAS Probe über Kupfer filtrierte und nicht filtrierte, junge Proben von P Gerät PE 4100 Modus Flamme (Air) Wellenlänge 325 nm (Kupfer) Sauerstoff 5 l/min Acetylen 0,9 l/min Referenz Cu-Standard 1000 mg/l (Merck: Artikel: 102630) An dem oben beschriebenen Eluat der Kupfer-Säulenchromatographie konnte eine Kontamination mit Kupfer von 0,7 mg/l P nachgewiesen werden. In der nicht behandelten Probe wurde dagegen kein Kupfer gefunden. - 136 - Verfahren zur Schnellreifung von P Für die produktionstechnische Umsetzung ist daher ein direkter Kontakt des Destillats mit Kupfer zu vermeiden. Die Reduzierung der Gehalte an Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan muss somit während der Destillation, vor der Kondensation, erfolgen. Um den Kupfergehalt des Destillationsrückstandes ebenfalls nicht zu erhöhen, wird vorgeschlagen, die Wirkung des Kupfers über Drahtgewebe bzw. Gasematten im Dampfraum der Destillationsblase auszuüben. Das dabei entstehende Kupfersulfid kann mit Hilfe von Mineralsäuren entfernt werden, was den Filter regeneriert. Dieser Vorgang muss allerdings unter besonderer Berücksichtigung der Arbeitssicherheit erfolgen und dementsprechend geplant werden. Ein Ersatz der kostenintensiven Aktivkohlefiltration bei gleichzeitiger Verkürzung der Lagerzeiten durch die Erhöhung des Kupferpotentials in der Destillationsblase scheint möglich und aus ökonomischer Sicht geboten zu sein. Allerdings stehen die Funktionskontrolle eines solchen Filters während der großtechnischen Herstellung und die Sicherstellung der gleichbleibenden Produktqualität von P derzeit noch aus. - 137 - Diskussion 8. Diskussion 8.1 Wertung der Untersuchungsergebnisse und -verfahren In den ersten Wochen nach Herstellung des Phytopharmakons P treten geruchliche Veränderungen auf, die von einem unangenehmen, untypischen, flüchtigen Fehleindruck zu einem angenehmen, produkttypischen Geruch führen. Der Fehleindruck von P verschwand zwar bei Verdünnung des Destillates auf Trinkstärke, da das Auftreten des anfänglichen Fehlgeruchs aber nicht durch Variationen der Qualität der eingesetzten Drogen erklärt werden konnte, wurde die Frage nach der Stabilität des Produktes und den Ursachen der Aromaveränderungen während der Reifeperiode aufgeworfen. Zunächst wurden daher durch eine Reihe äußerer Einflussnahmen unterschiedliche Geruchszustände an P mit unterschiedlicher Präferenz erzeugt (vgl. Kapitel 4.1.3, S. 48 bzw. Kapitel 5.18, S. 70). So konnte die während der Lagerzeit ablaufende Geruchsverbesserung z.B. mehr oder weniger durch den Zusatz von Aktivkohle, Wasser oder metallischem Kupfer beschleunigt werden. Durch Herabsetzung der Temperatur während der Lagerung ließ sich die Geruchsverbesserung verlangsamen bzw. durch den Zusatz von Säure der Fehleindruck verstärken (vgl. Kapitel 5.1.1 – 5.1.7, S. 64 ff.). Zwischen diesen verschiedenen Geruchszuständen galt es, stoffliche, aromarelevante Unterschiede aufzudecken und zu bewerten. Zu der speziellen Fragestellung der Geruchsveränderungen lagen weder für die zu betrachtenden Arzneidrogen noch für das Produkt selbst Veröffentlichungen vor, die zur Klärung oder Eingrenzung des sensorischen Problems hätten herangezogen werden können. Die theoretische Übertragung der Frage auf bekannte Probleme der Getränketechnologie oder der Aromachemie in Lebensmitteln war aufgrund der besonderen Zusammensetzung von P problematisch. Zur Klärung der gestellten Aufgabe musste daher eine umfassende olfaktorische wie instrumentelle Analyse der unterschiedlichen Geruchszustände von P erarbeitet werden. Im Ergebnis dieser Untersuchungen wurden erstmals mittels Gaschromatographie-Olfaktometrie (GCO) bzw. der Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) 36 geruchsaktive Substanzen selektiert, von denen 21 mit Hilfe der GC/MS-Methode identifiziert werden konnten. Fünf dieser Verbindungen wurden aufgrund ihrer makro-olfaktorischen Merkmale der Gruppe der Fehlgeruchsstoffe und 11 der Gruppe der positiv empfundenen Aromastoffe zugeordnet. Die restlichen 5 Verbindungen konnten ad hoc keiner der beiden Gruppen zugewiesen werden (vgl. Übersicht, S. 95). Bei der Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) wurden 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol in Ethanol als die Verbindungen identifiziert, die das produkttypische Aroma von gelagertem P prägen. Es wurde allerdings festgestellt, dass sich ihre Konzentrationen zwischen makro-olfaktorisch verschiedenen Zu- 138 - Diskussion ständen nicht unterscheiden. Die Annahme, der anfängliche Fehleineindruck könnte durch temporäre Konzentrationsänderungen der prägenden Aromastoffe bedingt sein, konnte somit nicht gestützt werden. Der anfängliche Fehleindruck muss daher substanziell bedingt sein. In einer Reihe von Untersuchungen mittels HS/GCO waren die niedermolekularen Schwefelverbindungen Dimethylsulfid, Methylmercaptan und Schwefelwasserstoff aufgefallen, wobei der mikro-olfaktorische Charakter des Methylmercaptans dem des anfänglich bemerkbaren Fehleindrucks von P am ehesten entsprach. Anhand von hinreichenden und notwendigen Bedingungen der Geruchsstoffwahrnehmung (vgl. Kapitel 3.6.4, S. 41) konnte die Zuordnung der Geruchsstoffe zu den unterschiedlichen makro-olfaktorischen Zuständen verifiziert werden. Dabei wurde vor allem versucht, die unangenehmen Gerüche, deren Gasphasenkonzentration bei einer makro-olfaktorischen Verbesserung abnehmen müssen, von den angenehm empfundenen, die analog hätten gebildet werden müssen, zu unterscheiden und deren Verteilungsverschiebungen zwischen flüssiger und gasförmiger Phase instrumentell-analytisch aufzuzeigen. Vor allem die instrumentell-analytisch nachweisbaren Unterschiede zwischen den einzelnen Geruchszuständen von P halfen, die Zuordnung empfundener Geruchsassoziationen zu den beiden Geruchsstoffklassen „angenehm“ und „unangenehm“ zu objektivieren. Während die Substanzen 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol die Grundvoraussetzung der stofflichen Veränderung zwischen zwei unterschiedlichen Geruchszuständen von vornherein nicht erfüllt hatten, stand das stoffliche Verhalten von Methylmercaptan und Schwefelwasserstoff mit allen, durch äußere Einflüsse erzielten makro-olfaktorischen Veränderungen in Einklang. So nahmen beide Schwefelverbindungen während der Lagerzeit und nach Wasserzusatz ab und konnten durch Säurezusatz aus P in die Gasphase gedrängt werden. Der einzige Unterschied war, dass sich Schwefelwasserstoff im Gegensatz zum Methylmercaptan besser mit Aktivkohle als mit Kupfer aus P entfernen ließ. Die olfaktorisch eindrucksvolle Wirkung des Kupfers und die dadurch bedingte unterschiedlich starke Abnahme der beiden Fehlgeruchsstoffe zeigte, dass der Anteil des Methylmercaptans am anfänglichen Fehlgeruch größer ist als der des Schwefelwasserstoffs. Eine Beteiligung von Dimethylsulfid am Fehleindruck konnte nicht nachgewiesen werden. In Verbindung mit ihren für P ermittelten Geruchsschwellen von je 5 µg/l und ihrem Autreten in Konzentrationen zwischen 10 und 50 µg/l direkt nach der Herstellung lassen sich für beide Fehlgeruchsstoffe Aromawerte von 2 bis 10 ableiten. Damit ist auch die Bedingung erfüllt, dass die problemrelevanten Verbindungen in P in Konzentrationen über der Geruchsschwelle vorliegen - 139 - Diskussion müssen (vgl. Kapitel 3.6.4, S. 41). Werte in dieser Größenordnung sind im Vergleich zu anderen bekannten Aromastoffen von Lebensmitteln eher gering. Allerdings waren auch die ermittelbaren stofflichen Veränderungen bei makroolfaktorisch registrierten Verbesserungen nicht sehr groß und lagen meist bei einer Verringerung um 50 bis 80 %. Aufgrund dessen wird angenommen, dass die ermittelten Aromawerte der Verbindungen zur Ausprägung des Fehleindrucks ausreichen. Der Zusatz von Wasser führte nicht nur zu einer Verschiebung des Gleichgewichts der Fehlgeruchsstoffe in die flüssige Phase, sondern auch zu einer Verschiebung der positiv empfundenen, produktprägenden Geruchsstoffe in die Gasphase. Diese „aktive“ Unterstützung der wahrgenommenen Geruchsverbesserung gibt Hinweise auf mögliche weitere Prozesse, die die Geruchsverbesserung an P bedingen können. Hiermit im Zusammenhang stehen auch die Geruchsbildveränderungen durch die erneute Destillation oder die Alkalisierung. Die durch die Ausgrenzung der, aufgrund von Deprotonierung ihre Flüchtigkeit einbüßenden Verbindungen, wie z.B. Eugenol, zu verzeichnende Verfremdung des Geruchs von P, könnte den Missstand der nur unvollständig gelungenen Rekonstruktion des Fehlgeruchs durch Zugabe der beiden Schwefelverbindungen relativieren. Obgleich die vollständige Nachahmung nicht gelang, wird daher und aufgrund des Geruchscharakters der beiden Fehlgeruchstoffe, ihrer hohe Flüchtigkeit und Polarität davon ausgegangen, dass beide den größten Teil des unangenehmen Geruchseindrucks an P verursachen. Hinweise für die Bildung positiv empfundener Geruchsstoffe während der Lagerperiode wurden nicht entdeckt. Eine Beteiligung wertbestimmender, ätherischer Ölkomponenten an den beobachteten olfaktorischen Veränderungen ist damit ausgeschlossen, was die Stabilität des Produktes unterstreicht. Die Untersuchung der schwefelhaltigen Substanzen stellte hohe Anforderungen an die Analysentechnik. Dies zeigte sich vor allem während der Optimierung der Probenvorbereitung, speziell der GC-Aufgabetechnik. Dabei stellte sich die direkte HS/GC-Kopplung für Methylmercaptan als das geeigneteste Verfahren heraus. Für Screening-Untersuchungen, wie sie beim Vergleich von Geruchsprofilen im Allgemeinen und speziell im vorliegenden Fall zunächst unerlässlich waren, war diese Technik dagegen nicht geeignet. Schwerer flüchtige Verbindungen wie z.B. 1,8-Cineol, Zimtaldehyd oder Eugenol konnte nur schlecht oder gar nicht mehr erfasst werden (vgl. Kapitel 5.2.5.6, S. 82, Abb. 5-15). Insbesondere Methylmercaptan verhielt sich bei der Optimierung der Headspace-Aufgabetechnik entgegengesetzt den Erwartungen bzw. dem Verhalten anderer Substanzen. So nahm seine Nachweisbarkeit bei erhöhten Probentemperaturen und größeren Analysenmengen im HS-Vial ab, wodurch die - 140 - Diskussion Analyse nur auf Kosten der Nachweisempfindlichkeit anderer, auch der oben genannten Verbindungen durchgeführt werden konnte. Die objektiv, instrumentell-analytische Identifizierung von Schwefelwasserstoff im unteren µg/kg-Bereich war noch schwieriger und konnte erst durch den Einsatz eines hochauflösenden Massenspektrometers realisiert werden. Schwefelwasserstoff zeigte sich zudem als überaus instabil. Eine Halbwertszeit von nur neun Stunden in kleinen Volumina von P verdeutlicht die Flüchtigkeit bzw. Reaktivität dieser Verbindung und die Schwierigkeiten, diese sicher nachweisen bzw. quantifizieren zu können. Sowohl die Dampfraum(Headspace)-Analyse als auch die destillative Anreicherung stellten sich als relativ schonende Verfahren zur Konzentrierung der beschrieben Schwefelverbindungen heraus. Anreicherungsverfahren wie die Festphasen-Mikroextraktion (SPME), extraktive Anreicherungen mit unpolaren Lösemitteln oder die Kondensation in Kühlfallen waren dagegen für die Fraktion der niedermolekularen Schwefelverbindungen nicht geeignet. Das Ergebnis der flüssig-flüssig Extraktion von P mit n-Pentan im Vorfeld der Untersuchungen war z.B. besonders richtungsweisend. Die Tatsache, dass sich der Fehleindruck nicht mit unpolaren Lösemitteln anreichern ließ, war sowohl für die Nichtheranziehbarkeit der meisten Literaturangaben über ätherische Öldrogen als auch für den anfänglichen Widerspruch zwischen der vermuteten hohen Flüchtigkeit potentieller Fehlgeruchssubstanzen und der durch die Extraktion nachgewiesenen Polarität maßgeblich verantwortlich. Allgemein kann bestätigt werden, dass alle Anreicherungsverfahren und Aufarbeitungsschritte bei der Analyse von Geruchsprofilen ein hohes Verfälschungspotential beinhalten. Die beobachteten Unterschiede zwischen den Analysenergebnissen der AEVA und der HS/GCO führten zum Bewerten der Anwendbarkeit beider Verfahren bei der Untersuchung von Geruchsprofilen bzw. leichtest flüchtigen Verbindungen. Obwohl Methylmercaptan mit der direkt gekoppelten HS/GCO bei nahezu jeder sensorisch negativ aufgefallenen Probe mikro-olfaktorisch wahrgenommen werden konnte, galt dies nicht für den typischen, leicht zu erkennende Geruch von 1,8-Cineol. Damit muss aber auch die Bedeutung aller schwerer flüchtigen Geruchsstoffe für die Untersuchung des Geruchsphänomens an P, die nach der Flüssiginjektion und Verdampfung bei der AEVA sowohl positiv als auch negativ empfunden wurden, in Frage gestellten werden. Obwohl die erhaltenen hohen Verdünnungsfaktoren eine Brauchbarkeit der direkten Flüssiginjektion der Labormuster signalisierten, scheint die Technik der AEVA mit Flüssiginjektion für leichtest flüchtige Aromastoffe (z.B. mit einem Siedepunkt unter 10 °C) wenig geeignet zu sein. Da sich der bei P anfangs bestehende Verdacht, der Fehlgeruch könnte der Kopfnote des Aromas zugeordnet werden, bestätigt hat, scheint die AEVA bei der Aufklärung von Angerüchen nur eingeschränkt anwendbar zu sein. - 141 - Diskussion 8.2 Herkunft und Genese der Fehlgeruchsstoffe Viele bekannte Fehlgeruchsstoffe, darunter auch Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan, entstehen in Lebensmitteln aufgrund von mikrobiologischen oder thermisch indizierten Reaktionen (vgl. Kapitel 6.4, S. 130). Da bei P mikrobiologische Prozesse aufgrund der hohen Ethanolkonzentration ausgeschlossen werden konnten, mussten andere Mechanismen während der Destillation zur Freisetzung dieser Verbindungen aus dem eingesetzten Pflanzenmaterial führen. Da sich bereits beim Erwärmen wässrig-alkoholischer Lösungen von Cystein ein Geruch nach Schwefelwasserstoff wahrnehmen läßt, müssen neben den Mechanismen der MAILLARD-Reaktionen (Bildung von N-Glykosiden und daraus resultierenden Umlagerungs- und Folgereaktionen) noch andere Fragmentierungswege des Moleküls existieren. Eine mechanistische Modellvorstellung könnte hier die Bildung des ß-Lactons 3-Amino-oxetan-2-on sein, bei dessen Bildung durch eine intramolekulare Austauschreaktion (Nachbargruppeneffekt) HS- als nucleofuge Abgangsgruppe durch den Angriff der Carboxylatgruppe auf das ß-C-Atom des Cysteins verdrängt wird (vgl. FIESER und FIESER, 1972, S. 375): Cystein Schwefelwasserstoff "Oxetan" O H2N O O H3N + H S H O H S ? H2C O H2N OH C H NH 2 + CO2 + NH3 H2O HO C2H5OH Serin Ethanol - 142 - Ammoniak Abb. 8-1: Mögliche Abbauwege von Cystein in wässriger Lösung Diskussion ß-Lactone sind stabiler als entsprechende dreigliedrige Verbindungen und stellen nicht notwendigerweise nur Übergangsstufen dar. Unter Erwärmung ist aber eine Decarboxylierung wahrscheinlich (EICHER und HAUPTMANN, 1994, S. 40), wobei hypothetisch Vinylamin im Übergangsstadium entstehen müsste. Dieses Enamin würde aber sofort zu Ethanol und Ammoniak hydrolisieren. Auch eine Ringöffnung zu Serin kann diskutiert werden. Bei Methionin würde analog aufgrund des beschriebenen Nachbargruppeneffekts ein γ-Lacton unter Freisetzung von Methylmercaptan gebildet werden. Die zusätzliche Methylengruppe schwächt den Nachbargruppeneffekt aber ab, was die gefundene verzögerte Freisetzung erklären könnte. In Gegenwart des Pflanzenmaterials sind Reaktionen, die durch eine N-Glykosidbildung initiert werden, als möglich einzustufen. Auch der Mechanismus der ß-Eliminierung läuft nach TRESSL et. al. (1994, S. 226/227) selbst bei pHWerten von 5 bis 6 ab. Für alle postulierten Reaktionswege sind die beobachteten Einflüsse des pH-Wertes jedenfalls erklärbar. So läuft die MAILLARD-Reaktion bekanntermaßen, die ß-Eliminierung durch Verlust der Base bei niedrigen pH-Werten verlangsamt ab. Für die Lactonbildung würde eine Protonierung der Carboxylatgruppe eine Verschlechterung des nucleophilen Angriffs auf das ß- bzw. γ-C-Atom bedeuten. Die Untersuchungen der beiden Aminosäuren L-Methionin und L-Cystein, die in P im unteren µmol/kg-Bereich frei vorhanden nachgewiesen werden konnten, belegen die Möglichkeit der thermisch bedingten Freisetzung sowohl von Schwefelwasserstoff aus L-Cystein als auch die von Methylmercaptan aus LMethionin. Wird die Einsatzmenge an Drogen sowie die Ausbeute an P zugrundegelegt, würde bei vollständigem Abbau aus dem freien Methionin etwa 100 µg/l Methylmercaptan und aus dem freien Cystein etwa 15 µg/l Schwefelwasserstoff freigesetzt werden. Da der Gesamtschwefelgehalt der Drogen mit ca. 1 % S (ca. 280 mmol Schwefel/kg) physiologisch nicht ungewöhnlich ist (vgl. VOET und VOET, 1992, S. 22), ist die Annahme berechtigt, dass die beiden betrachteten Aminosäuren in weitaus höheren Konzentrationen im Pflanzenmaterial vorliegen als durch die methanolische Extraktion erfasst und mittels HPLC analysiert werden konnte (vgl. Kapitel 6.2, S. 129). Obgleich in Peptiden andere Fragmentierungsmechanismen gelten müssen, bleibt festzustellen, dass eine Freisetzung der beiden Fehlgeruchsstoffe in den beschriebenen Konzentrationen durch thermischen Abbau von L-Cystein und LMethionin als möglich und wahrscheinlich anzusehen ist. - 143 - Diskussion 8.3 Abbau der Fehlgeruchssubstanzen Die Abnahme der beiden Fehlgeruchsstoffe Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan während der Lagerzeit kann vielfältig begründet sein. So können beide z.B. durch Oxidation ihre Flüchtigkeit verlieren oder mit Metallen, Ethanol oder anderen Substanzen zu geringer flüchtigen oder anders riechenden Verbindungen (z.B. Ethanthiol, Dimethyldisulfid, CuS u.a.) reagieren. Sie können aber auch physikalisch bedingt ausgasen. Die hohe Flüchtigkeit und die Beobachtung der schnellen Geruchsverbesserung an kleinen Volumina von P sprechen für eine solche Möglichkeit. Da aber für keine dieser Möglichkeiten in Laborexperimenten eine eindeutige Bestätigung gefunden werden konnte, können die genauen Mechanismen der Gehaltsabnahmen der beiden Fehlgeruchsstoffe während der Lagerperiode nicht abschließend benannt werden. Bei der Analyse der Destillationsfraktionen wurde festgestellt, dass Methylmercaptan und vor allem Schwefelwasserstoff erst relativ spät im Destillationsprozess übergingen. Dieses Verhalten konnte auch im Labor simuliert werden. Hieraus folgte, dass eine Herabsetzung des Gehaltes der Fehlgeruchsstoffe in P durch Veränderung des Destillationsprozesses, z.B. im Sinne einer Abtrennung eines Vorlaufes, nicht möglich ist. Auch eine nachgewiesene Reduktion der Freisetzung durch pH-Wert-Absenkung wäre aus herstellungstechnischen Gründen nicht praktikabel. Eine makro-olfaktorisch wirksame Reduzierung des unangenehmen Geruchseindrucks und damit die Möglichkeit der Verkürzung der Reifezeiten und Verringerung der Lager- und Bearbeitungskosten gelang dagegen durch die Kontaktkatalyse mit metallischem Kupfer. Da weder der Destillationsrückstand noch das Destillat mit Kupfer in Berührung kommen sollten, um eine Kontamination mit Kupfer zu vermeiden (vgl. Kapitel 7, S. 135), wird die Gehaltsreduktion der Schwefelverbindungen im Dampfraum während der Destillation vorgeschlagen. Obwohl die Aktivkohle-Filtration auf die Reduzierung des Schwefelwasserstoffgehalts einen größeren Einfluss als der Kupferzusatz hatte, wird ein vollständiger Ersatz der Aktivkohle-Filtration aus ökonomischen wie olfaktorischen Gründen für möglich gehalten, da sich die Einflüsse auf die Reduzierung des olfaktorisch bedeutenderen Methylmercaptans genau umgekehrt darstellen. Nebenwirkungen dieser Behandlung auf andere Inhaltsstoffe von P sind bisher nicht bekannt. Diese Aussage ist allerdings bei der großtechnischen Umsetzung erneut zu überprüfen, um die bisher nachweisbare Stabilität von P nicht zu gefährden. - 144 - Zusammenfassung 9. Zusammenfassung Der an dem aus offizinalen Öldrogen gewonnenen, wässrig-alkoholischen Heilkräuterdestillat direkt nach der Herstellung aufgetretene und sich während einer mehrwöchigen Lager- und Reifeperiode sich abbauende, unangenehme Geruchseindruck kann auf die Gegenwart der Fehlgeruchsstoffe Schwefelwasserstoff und Methylmercaptan zurückgeführt werden. Beide Verbindungen kommen direkt nach der Herstellung des Destillats in Konzentrationen von 10 bis 50 µg/l vor. Ihre Geruchsschwelle im Produkt liegt bei 5 µg/l. Es wurde gezeigt, dass die Konzentration der beiden Fehlgeruchsstoffe im Destillat während einer Reifeperiode abnimmt. Beide Verbindungen konnten zudem durch Aktivkohlefiltration, Zusätze metallischen Kupfers und Erhöhung des Wasseranteils nachhaltig aus dem Dampfraum über dem Untersuchungsobjekt entfernt werden. Das Auftreten beider Verbindungen kann durch thermische Abbauprozesse der im eingesetzen Pflanzenmaterial nachgewiesenen Aminosäuren L-Cystein und L-Methionin bei der Herstellung des Destillats erklärt werden. Das produkttypische Aroma wird durch die Verbindungen 1,8-Cineol, Linalool und Eugenol geprägt. Für eine Zunahme der Konzentration dieser als angenehm empfundenen oder anderer, den Geruch aktiv verbessernder Stoffe während der Reifung konnten keine Hinweise gefunden werden. Es wurde beschrieben, wie mit Hilfe der Gaschromatographie-Olfaktometrie (GCO) und der Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) sensorisch relevante Verbindungen aus dem Vielstoffgemisch des Destillats identifiziert und Geruchszuständen zugeordnet wurden. Gehaltsunterschiede dieser geruchsaktiven Verbindungen zwischen unterschiedlichen Geruchszuständen des Heilkräuterdestillats wurden instrumentell-analytisch ermittelt. In Verbindung mit der ermittelten Geruchsschwellenkonzentration dienten diese Daten der stofflichen Veränderung der Bestätigung der Geruchsstoffzuordnung. Die Optimierung und Vorzüge der artefaktarmen Headspace-Analyse in Kombination mit GC/MS und GCO für die Untersuchung leichtest flüchtiger Verbindungen wurden gegenüber anderen Anreicherungstechniken und der Flüssiginjektion von Aromaextrakten dargestellt und erläutert. Es wurde ein Verfahren beschrieben, mit dem sich auf der Basis der Kontaktkatalyse mit metallischem Kupfer die beiden schwefelhaltigen Fehlgeruchssubstanzen während der industriellen Fertigung aus dem Produkt entfernen lassen. - 145 - Anhang I Anhang I Verkostungsprotokoll A, Trio-Vergleichstest Artikel: Charge: Tank: Nr 1 Geruch der unverdünnten Probe krautig nicht krautig entspricht der Norm streng mild entspricht weitgehend, noch i.O. nicht abgerundet abgerundet entspricht nicht muffig nicht muffig Bemerkung: krautig nicht krautig streng mild nicht abgerundet abgerundet muffig nicht muffig Geschmack der krautig verdünnten scharf Probe nicht krautig Geruch der verdünnten Probe mild nicht abgerundet abgerundet muffig nicht muffig Beigeschmack kein Beigeschmack Nachbrennen kein Nachbrennen krautig nicht krautig entspricht der Norm streng mild entspricht weitgehend, noch i.O. nicht abgerundet abgerundet entspricht nicht muffig nicht muffig Bemerkung: krautig nicht krautig streng mild nicht abgerundet abgerundet muffig nicht muffig Geschmack der krautig verdünnten scharf Probe nicht krautig Nr 2 Geruch der unverdünnten Probe Geruch der verdünnten Probe mild nicht abgerundet abgerundet muffig nicht muffig Beigeschmack kein Beigeschmack Nachbrennen kein Nachbrennen (Fortsetzung nächste Seite) - 146 - Anhang I Nr 3 Geruch der unverdünnten Probe krautig nicht krautig entspricht der Norm streng mild entspricht weitgehend, noch i.O. nicht abgerundet abgerundet entspricht nicht muffig nicht muffig Bemerkung: krautig nicht krautig streng mild nicht abgerundet abgerundet muffig nicht muffig Geschmack der krautig verdünnten scharf Probe nicht krautig Geruch der verdünnten Probe mild nicht abgerundet muffig nicht muffig Beigeschmack kein Beigeschmack Nachbrennen Prüfer: abgerundet kein Nachbrennen Datum: Unterschrift: - 147 - Anhang I Verkostungsprotokoll B Prüfer:_______________________Datum:__________________ Aufgabenstellung: Bitte riechen Sie am Inhalt der vor Ihnen stehenden Reihe an Verkostungsgläsern. Fangen Sie mit dem Glas Nr. 1 am linken Ende an und gehen Sie dann Glas für Glas nach rechts weiter. Bei welchem Glas merken Sie im Vergleich zum vorherigen Glas eine Geruchsänderung? Versuchen Sie diese Geruchsänderung zu beschreiben. Bei welchem Glas können sie die Geruchsänderung eindeutig identifizieren? Wiederholungen sind nicht erlaubt, riechen Sie an jedem Glas nur einmal. Glas-Nr. Beschreibung/Anmerkung _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ _____________________________ - 148 - Anhang I Verkostungsprotokoll C Prüfer:_______________________Datum:__________________ Aufgabenstellung: Vor Ihnen stehen 3 x 3 Verkostungsgläser. Bitte heben Sie nach gelegentlichem Umschwenken den Deckel und riechen Sie einmal vorsichtig aber bestimmt am Inhalt. Achten Sie dabei auf einen unangenehmen, schwefeligen, faulig, kohligen Geruch. Bitte vergleichen Sie in den unten angegeben Gruppen den Geruch und vergeben Sie Noten (1 = ohne Fehlgeruch bis 3 = mit Fehlgeruch). Versuchen Sie den Geruch der schlechtest riechenden Probe zu beschreiben. Glas 31 Note Glas Note Glas Note Ü32 Ü33 Glas Note Glas Note Glas Note 31 32 ê 21 Ü22 Ü23 21 ê 22 ê 11 Ü12 Ü13 11 - 149 - 33 ê 23 ê 12 ê 13 Anhang II Anhang II Im Folgenden sind die Ergebnisse der MS-Spektren-Vergleiche von P mit Bibliotheksspektren für alle wesentlichen olfaktorischen Verbindungen aufgeführt. Das obere Spektrum ist jeweils das Probenspektrum, das untere das der Referenz. Ein Maß für die Übereinstimmung und damit für die Wahrscheinlichkeit der Gegenwart der betreffenden Verbindung in P ist durch den „Reverse fit factor [REV]:“ in der rechten Ecke oben gegeben. 1000 würde eine maximale Übereinstimmung zwischen Referenz- und Probenspektrum bedeuten. Massenspektrum von Schwefelwasserstoff Sample ID: # 945 247 unf iltriert des t 10:1 Acquire d on 18- Jun-1997 at 23:47:00 Reve rse fit factor [REV ]: 969 D EST04 50 (2.750) R f (6,3.000) 2.89e3 34 100 32 % 40 85 89 55 57 58 70 0 R:969 101 105 131 133 147 NIST 19: HYDROGEN SULFIDE Hit 1 34 100 32 % 1 36 0 m/z 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Massenspektrum von Methylmercaptan Sample ID: # 945 247 unfiltriert dest 10:1 Acquired on 18-Jun-1997 at 23:47:00 Reverse fit factor [REV]: 976 DEST04 102 (3.530) Cm (102-(99+105)) 1.51e4 47 48 100 45 % 44 49 32 33 72 0 R:976 WILEY 197: METHANETHIOL (CAS) $$ MERCAPTOMETHANE $$ METHYL MERCAPTAN 47 100 Hit 1 48 45 % 33 34 0 44 49 m/z 30 40 50 60 70 80 90 - 150 - 100 110 120 130 140 150 Anhang II Massenspektrum von Dimethylsulfid Sample ID: # 945 247 unfiltriert des t 10:1 Acquire d on 18-Jun-1997 at 23:47:00 Reve rse fit factor [REV]: 991 DEST04 158 (4.371) Cm (158-(154+164)) 6.04e4 62 47 100 45 % 61 35 29 0 R:991 100 44 48 37 63 57 58 WI LEY 594: METHANE, THIOBIS- (CAS) $$ 2-THIAPROPANE $$ DMS $$ METHYLTHIOMETHANE $$ METHYL SULFIDE Hit 1 47 62 45 % 61 35 34 0 44 63 49 57 58 37 m/z 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 Massenspektrum von 1,8-Cineol Sample ID: # 945 247 unfiltriert Acquired on 18-Jun-1997 at 22:42:24 Reverse fit factor [REV]: 993 DEST03 1165 (19.476) Cm (1165-(1159+1172)) 2.98e5 43 100 81 % 41 55 39 0 R:993 69 71 29 31 51 53 58 84 85 72 79 65 108 111 93 96 68 107 91 139 121 125 136 154 140 155 ETHERIC 10: 1,8-CINEOL Hit 1 43 100 % 69 55 41 39 44 53 58 71 81 84 85 77 79 108 111 93 96 68 91 139 121 125 97 136 140 154 155 0 m/z 30 40 50 60 70 80 90 - 151 - 100 110 120 130 140 150 160 Anhang II Massenspektrum von Linalool Sample ID: # 945 247 unfiltriert Acquired on 18-Jun-1997 at 22:42:24 Reverse fit factor [REV]: 986 DEST03 1979 (31.687) Cm (1978:1980-(1974+1990)) 5.33e4 41 100 71 93 43 55 % 69 39 67 53 80 77 56 29 38 91 94 121 107 136 0 R:986 ETHERIC 79: (±)-LINALOOL Hit 1 71 100 41 43 55 93 69 % 39 80 67 53 56 83 94 72 29 107 121 136 0 m/z 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Massenspektrum von Eugenol Sample ID: # 945 247 unfiltriert Acquired on 18-Jun-1997 at 22:42:24 Reverse fit factor [REV]: 982 DEST03 2838 (44.572) 1.99e6 164 100 % 77 29 32 39 45 55 65 91 78 103 94 66 149 131 105 121 147 150 0 R:982 100 165 166 WILEY 36300: PHENOL, 2-METHOXY-4-(2-PROPENYL)- (CAS) $$ EUGENOL $$ 1-(2-PROPENYL)-4-HYDROXY-3-METHOXYBENZENE Hit 1 164 % 55 39 51 29 77 91 65 66 149 103 105 121 78 131 81 147 150 166 0 20 40 60 80 165 100 120 - 152 - 140 160 180 200 220 m/z 240 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis Abbott, Nerida et al. (1993): Critical Evaluation of Two Commonly Used Techniques for the Treatment of Data from Extract Dilution Sniffing Analysis. J. Agric. Food Chem., 41, S. 1698-1703 . Acree, Terry E et al. (1971): Determination of Hydrogen Sulfide in Fermentation Broths Containing SO2. Applied Microbiology, July, S. 110-112. Acree, Terry E (1993): Bioassays for Flavor. Aus: Flavor science, sensible principles and techniques, Acree, Terry E und Roy Teranishi [Hrsg.] ACS prefessional reference books, Washington DC, S. 1-20. Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG, 36. Lieferung, 1998, Berlin, Köln: Beuth-Verlag. Arroyo, PT und Da Lillard (1970): Identification of carbonyl- and sulfur-compounds from nonenzymatic browning reactions of glucose and sulfur-containing amino acids. J. Food Sci., Volume 35, S. 769-770. Arzneimittelgesetz (AMG) vom 19. Oktober 1994 Atkins, Peter (1990): Physikalische Chemie. Weinheim: VCH. Baltes, Werner (1992): Lebensmittelchemie. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag. Bärwald, G (1971): Die Schwefelverbindungen im Brauprozeß. Der Brauereitechniker, Jg. 23, Nr. 17, S. 130-134. Bauer, Kurt, Dorothea Garbe und Horst Surburg (1997): Common Fragrance and Flavor Materials. 3. Auflage, Weinheim: Wiley-VCH. Becker, Walter, Hans Heinz Naumann und Carl Rudolf Pfaltz (1983): HalsNasen-Ohren-Heilkunde. 2. überarb. Aufl., Stuttgart, New York: Thieme. Belitz, Hans-Dieter und Werner Grosch (1992): Lehrbuch der Lebensmittelchemie. 4. Auflage, Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag. Bemelmans, JMH und MC Ten Noever de Brauw (1975). Analysis of offflavours in food. Proceeding of the International Symposium on Aroma Research, Zeist, Netherlands. Centre for Agricultural Publication and Documentation (Pudoc) [Hrsg.], S. 85. Berry, Robert et al. (1983): Citrus Oil Flavor and Composition Studies. Food Technol., S. 88-91. Brdicka, Rudolf (1985): Grundlagen der physikalischen Chemie. 15. Auflage, Berlin: Deutscher Verlag der Wissenschaften. Bruhn, Wolfgang (1990): Grenzen der Gaschromatographie bei der Analyse des Geruchs. Aus: Analytik in der Kosmetik. Möglichkeiten, Grenzen und Bewertung. Fachgruppe „Analytik“ der Deutschen Gesellschaft für wissenschaftliche und angewendete Kosmetik e.V. [Hrsg.], Augsburg: Verlag für chemische Industrie, S. 213 – 231. - 153 - Literaturverzeichnis Buchbauer, Gerhard und Sabine Selos (1997). Wie arbeitet der Geruchssinn. Deutsche Apotheker Zeitung 137. Jahrgang, Nr. 42, S. 81-100 (37193736). Buckholz, Lawrence L (1989): Maillard Technology as Applied to Meat and Savory Flavors. Aus: Thermal Generation of Aromas. McGorrin, TR und ChinTang Ho [Hrsg.], ACS Symposium Series 409, S. 406-420. Burmeister, MS et al. (1992): Measurement of Volatile Sulfur Compounds in Beer Using Gas Chromatography with a Sulfur Chemiluminescence Detector. J. Amer. Soc. Brew. Chem., Vol. 50, No. 2, S. 53-58. Cantagrel, R und JP Vidal (1989): Research on compounds responsible for cork Taint in cognacs. Aus: Flavours and Off-Flavours. Proceeding of the 6th International Flavor Conference, Rethymnon, Crete, Greece. G. Charalambous [Hrsg.], Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V. S.139157. Chen, AO (1992): Off-Flavors of Tea. Aus: Off-Flavors in Food and Beverages. G. Charalambous [Hrsg.], Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V., S. 375-410. Chin, HW und RC Lindsay (1993): Volatile Sulfur compounds Formed in Disrupted Tissues of Different Cabbages Cultivars. J. Food Sci., Volume 58, No. 4, S. 835-841. Chin, HW und RC Lindsay (1994): Modulation of Volatile Sulfur Compounds in Cruciferous Vegetables. Aus: Sulfur Compounds in Foods. Mussinan, C und M Keelan [Hrsg.], ACS Symposium Series 564, S. 90-104. Christensen, KR und GA Reineccius (1992): Gas Chromatographic Analysis of Volatile Sulfur Compounds from Heated Milk Using Static Headspace Sampling. J. Dairy Sci., 75, S. 2098-2104. Clark, BC und TS Chamblee (1992): Acid-catalysed reactions of citrus oils and other terpene-containing flavors. Aus: Off-Flavors in Food and Beverage, G. Charalambous [Hrsg.], Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V., S. 229-285. Deutsche Katadyn GmbH (1979): Programm zur Veredelung und Schnellreifung von Alkohol. Die Alkohol-Industrie, 4, S. 82-83. Dorner, WG (1988): Melisse: Modernes Phytopharmakon mit langer Geschichte. Aus: S. Edel [Hrsg.], Jahrbuch Pharmalabor, Weinheim: VCHVerlag, S. 93 – 106. Etiévant, PX et al. (1994): Aroma extract dilution analysis (AEDA) and the representativeness of the odour of food extracts. Aus: Trends in flavour Reseach. Maarse und van der Heij [Hrsg.], Amsterdam: Elsevier Science B.V., S. 179-190. Eicher, Theophil und Siegfried Hauptmann Heterocyclen. Stuttgart, New York: Thieme-Verlag. (1994): Chemie der Farrell, Kenneth T (1985): Spices, condiments and seasonings. Westport, Connecticut: AVI Publishing Company, Inc. - 154 - Literaturverzeichnis Fieser, Louis und Mary Fieser (1972): Organische Chemie. Weinheim: Verlag Chemie. Fliedner, Irmela (1989): Grundlagen und Prüfverfahren der Lebensmittelsensorik. Hamburg: Behr´s...Verlag. Forney, Charles F et al. (1991): Volatile Compounds Produced by Broccoli under Anaerobic Conditions. J. Agric. Food Chem., 39, S. 2257-2259. Frey, A (1934): Behandlung von Spirituosen mittels des Oxy-Esterators. Deutsche Destillateur-Zeitung, 55, S. 415. Gerbersmann, Claudia et al. (1995): Determination of volatile sulfur compounds in water samples, beer and coffee with purge and trap gas chromatography-microwave-induced atomic emission spectrometry. Analytica Chimica Acta, 316, S. 93-104. Grosch, Werner und Frank Ullrich (1987): Identification of the most intense volatile flavour compounds formed during autoxidation of linolic acid. Z Lebensm Unters Forsch A, 184, S. 277-282. Gustafsson, Lilly (1960): Determination of Ultramicro Amounts of Sulphate as Methylene Blue-I. Talenta, Vol.4 , S. 227-235. Guth, H (1997): Identification of Character Impact Odorants of Different White Wine Varieties. J. Agric. Food Chem., 45, S. 3022-3026. Guth, H und W Grosch (1993): Identification of Potent Odorants in Static Headspace Samples of Green and Black tea Powders on the Basic of Aroma Extract Dilution Analysis (AEDA). Flavour and Fragrance Journal, Volume 8, 173-178. Hagers Handbuch der pharmazeutischen Praxis (1995), von Bruchhausen, F [Hrsg.], 5. überarb Auflage, Berlin, Heidelberg, New York: Springer. Hänsel, Rudolf (1991): Phytopharmaka. Grundlagen und Praxis. 2. völlig überarb. Auflage, Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag. Harnischfeger, Götz (1985): Qualitätskontrollen von Phytopharmaka, Arbeitstechniken der pharmazeutischen Industrie. Band 6, Stuttgart, New York: Thieme-Verlag. Hatt, H (1997): Molekulare Prozesse der Duftwahrnehmung. SÖFW-Journal, 123. Jahrgang 11, S. 757-764. Hiltunen, R (1985): Quantitative Headspace Gas Chromatography in the Analysis of Volatile Oils and Aromatic Plants. Aus: Essential Oils and Aromatic Plants. Baerheim Svendsen, A und JJC Scheffer [Hrsg.], Manchester: Martinus Nijhoff/Dr W. Junk Publishers, S. 23-41. Hoffman, A et al. (1998): Advances in the Capillary Gas Chromatographic Analysis of Beverages using PTV Injection combined with Ancillary Sample Introduction Systems. Proceeding of the 20th Internationel Symposium on Capillar Chromatography, Mai, 26.-29., Riva del Garda, Italy. Horner, Gerhard (1998): Fragrances and Aroma Analysis using "Electronic noses". SÖFW-Journal, 124. Jahrgang, 9, S. 538-542. - 155 - Literaturverzeichnis Hübschmann, Hans-Joachim (1996): Handbuch der GC/MS. Grundlagen und Anwendung. Weinheim: VCH. Hunt, S (1985): Degradation of Amino Acids Accompanying in vitro Protein Hydrolysis. Aus: Chemistry and Biochemistry of Aminoacids, GC Barrett [Hrsg.], London, New York: Chapman and Hall, S. 376-398. Jagella, T und W Grosch (1998): Untersuchung von Aromaunterschieden bei schwarzem und weißem Pfeffer. Lebensmittelchemie 52, S. 101. Jander, Gerhart, Karl-Friedrich Jahr und Heinz Knoll (1973): Maßanalyse. Berlin, New York: Walter de Gruyter. Kaemmerer, K (1978): Gedanken über Geruchs- und Geschmacksstoffe. Aus: Aktuelle Themen der Tierernährung, Lohmann Tierernährung GmbH, Cuxhaven, S. 51-90. Keding, HJ und S Höger (1996): Smart Gas Sensor. Daimler-Benz Aerospace, RST Rostock Raumfahrt und Umweltschutz GmbH, November 1996. Keller, Patrick und Jörg-Uwe Meyer (1997): MORGAS, Modular Odor Recognition and Gas Analysis System. Mediendienst des Frauenhofer-Instituts für Biomedizin Technik, Ensheimer Str. 48, 66386 St. Ingbert. Kerscher, Roland und W Grosch (1997): Comparative evaluation of potent odorants of boiled beef by aroma extract dilution and concentration analysis. Z Lebensm Unters Forsch A, 204, S. 3-6. Kobayasi, Noboru und Masao Fujimaki (1965): On the Formation of Mercaptoacetaldehyd, Hydrogen Sulfide and Acetaldehyde on Boiling Cysteine with Carbonyl Compounds. J. Agric. Biol. Chem., Vol. 29, No. 7, S. 698-699. Kramer, A (1974): A non-parametric ranking method for the statistical evaluation of sensory data. Chem. senses and flavour 1, S. 121-133. Kumpmann, Iris (1998): Künstliche Nasen für die Olfaktometrie. Chemie in Labor und Biotechnik, 49. Jahrgang, Heft 7, S. 267-273. Land, Derek G (1989): Taints – causes and prevention. Aus: Destilled Beverage Flavour: Recent developments, Piggott, John R und A Peterson, [Hrsg.], Ellis Horwood. Chichester, S. 17-31. Lawless, Harry und Hildegarde Heymann (1998): Sensory Evaluation of Food. Principels and Practices. Weinheim: Chapman & Hall. Lawrence, William und Eward Cole (1968): Yeast Sulfur Metabolism and the Formation of Hydogensulfide in Brewery Fermentations. Wallerstein Communications, Vol. 31, No.105, S. 95-115. Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz (LMBG) in der Fassung der Bekanntmachung vom 8. Juli 1993 Lemperle, E (1981): Neue Untersuchungen zum Böckster des Weines. Weinwirtschaft, Nr. 5, S. 129-132. - 156 - Literaturverzeichnis Linskensen, HF und JF Jackson (1988): Beer Analysis. Berlin, Heildeberg, New York: Springer-Verlag. Luttrell, WR et al. (1981): Cooked Flavor in Sterile Illinois Soybean Beverage. J. Food. Sci., 46, S. 373-376+382. Maarse, H und F van der Berg (1989): Current issues in flavour reseach. Aus: Destilled Beverage Flavour: Recent developments, Piggott, John R und A Peterson, [Hrsg.], Ellis Horwood. Chichester, S 1-16. MacLeod, G und JM Ames (1986): Comperativ assessment of the artefact background on thermal desorption of Tenax GC und Tenax TA. J. Chromatogr., 355 (2), S. 393-398. Maga, Joseph A (1976): The Role of Sulfur Compounds in Food Flavor. Critic. Rev. Food Sci. Nutri., January, S. 147-192. Maga, Joseph A (1987): Musty/earthy aromas. Food Reviews International, 3, (3), S. 269-284. Martin, Norbert (1988): Modellumsetzungen von Cystein/Cystin und Methionin/S-Methylcystein mit reduzierenden Zuckern unter Druckkochungsbedingungen als Beitrag zur Kenntnis der Maillardreaktion. Dissertation an der Technischen Universität Berlin, Deutschland. Masanetz, C et al. (1998): Fishy and hay-like off-flavours of dry spinach. Z Lebensm Untersuch Forsch A, 206, S. 108-113. Masanetz, C und W Grosch (1998): Hay-like off-flavour of dry parsley. Z Lebensm Untersuch Forsch A, 206, S. 114-120. Masuda, Masahiro und Ki-I-Chin Nishimura (1981): Changes in Volatile Sulfur Compounds of Whisky During Aging. J. Food Sci., 47, S. 101-105. Matheis, Günter (1995): Trigeminale Wahrnehmungen in Nasen- und Mundhöhle. DRAGOCO-Bericht, Holzminden: Klein & Partner. Matsui, Toshiro et al. (1998): A comparative study of potent odorants in peanut, hazelnut, and pumpkin seed oils on the basis of aroma extrakt dilution analysis (AEDA) and gas chromatography-olfactometry of headspace-samples (GCOH). Lipid, 100, Nr. 2, S. 51-56. Mestres, M et al. (1997): Chromatographic Analysis of volatile sulphur compounds in wines using the static headspace technique with flame photometric detection. J. Chromatogr. A, 773, S. 261-269. Mevissen, Lutz (1986): Strukturaufklärung flüchtiger Reaktionsprodukte aus der Umsetzung von D-Glucose und L-Phenylalanin unter Koch und Röstbedingungen, Dissertation, TU Berlin, FB 13. Mistry, BS et al. (1994): Comparison of Gas Chromatographic Detectors for the Analysys of Volatile Sulfur Compounds in Foods. Aus: Sulfur Compouns in Foods. Mussinan C und M Keelan [Hrsg.], ACS Symposium Series 564, S. 821. Mussinan, Cynthia und Mary Keelan (1994): Sulfur Compounds in Food. An Overview. Aus „Sulfur Compouns in Foods“. Mussinan, C und M Keelan [Hrsg.], ACS Symposium Series 564, S. 1-7. - 157 - Literaturverzeichnis Narziß, L et al. (1985): Über das Verhalten von schwefelhaltigen Aromakomponenten beim Brauprozeß. Monatsschrift für Brauwirtschaft, 11, S. 439-445. Nedjma, Mustapha und Alain Maujean (1995): Improved chromatographic analysis of volatile sulfur compounds by static headspace technique on wateralcohol solutions and brandies with chemiluminescence detection. J. Chromatogr. A, 704 S. 495-502. Neumann, Ralph und Pal Molnár (1991): Sensorische Lebensmitteluntersuchung, Eine Einführung. 2. neubearb. Auflage, Leipzig: Fachbuchverlag. Nykänen, Lalli (1986): Formation and Occurence of Flavor Compounds in Wine and Distilled Beverage. Am. J. Enol. Vitic., Vol 37, No. 1, S. 84 – 96. Nykänen, Lalli und Heiki Suomalinen (1983): Aroma of Beer, Wine and Distilled Alcoholic Beverages. Berlin: Akademie-Verlag. Ohba, Toshiteru und Hiroichi Akiyama (1992): Off-Flavors of Sake. Aus: Off-Flavors in Food and Beverage, G. Charalambous [Hrsg.], Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V., S. 473-483. Ohloff, Günther (1990): Riechstoffe und Geruchssinn: Die molekulare Welt der Düfte. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag. Ohloff, Günther et al. (1985): Flavor Chemistry. Food Reviews International, 1(1), S. 99 –148. Peiseler-Sutter, Beate (1995): Weinanalytik am INRA in Colmar, Das Bukett wird vom "Terrior" beeinflußt. Chemische Rundschau, Nr. 15, S. 7. Peppard, T (1988): Analytical Measurement of Volatile Sulphur Compounds in Beer. Aus: Linskensen, HF und JF Jackson. Beer Analysis. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 1988, S. 241-253. Pharmazeutische Industrie (1997): Fortschritte in Entwicklung der "elektronischen Nase". [Hrsg.] Pharmazeutische Industrie, Vol. 59, Nr. 9, 1997, S. 779. Piggott, John R (1990): Relating sensory and chemical data to understand flavor. J. Sensory Studies, Nr. 4, S. 261-272. Rapp, A et al. (1992): Foreign and undesirable Flavours in wine. Aus: Off-Flavors in Food and Beverage, G Charalambous [Hrsg.], Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V. S. 485-522. Rauhut, D et. al (1993): Sulfur compounds and their influence on wine quality. Vitic. Enol. Sci. 48, S. 215-218. Reineccius, GA und R Liardon. (1985): The Use of Charcoal Traps and Mircowave Desorption for the Analysis of Headspace Volatiles above heated Thiamine Solutions. Aus: Topics in Flavour Reseach, Ralf G. Berger, Siegfried Nitz, Peter Schreier [Hrsg.], Marzlin-Hangenham: H. Eichhorn. Reiners, Jutta und W Grosch (1998): Odorants of Virgin Olive Oli with Different Flavor Profiles. J. Agric. Food Chem., 46, S. 2754-2763. Richter, Gerhard (1996): Biochemie der Pflanzen. Stuttgart, New York: Thieme-Verlag. - 158 - Literaturverzeichnis RÖMPP Chemielexikon (1995) hrsg. von Falbe, Jürgen und Manfred Regitz. Bd.2 Stuttgart, New York: Thieme-Verlag. Schadewaldt, Hans (1977): Arzneien, die Hände der Götter. Renaissance der Phytotherapie. Aus: Heilpflanzen und ihrer Kräfte. Thomson, William AR [Hrsg.], Stuttgart: Colibri-Verlag, S. 7-16. Schepper, Katja und Rolf Daniels (1997): „Künstliche Nasen“ in der pharmazeutischen Analytik. Pharmazeutische Zeitung PZ PRISMA, 4. Jahrgang, Nr. 4, S. 245-255. Schieberle, P et al. (1990): Evaluation of Potent Odorants in Cucumbers (Cucumis sativus) and Muskmelons (Cucumis melo) by Aroma Extract Dilution Analysis. J. Food Sci., Volume 55, No. 1, S. 193-195. Schmidt, Robert F und Gerhard Thews (1980): Physiologie des Menschen. 20. überarbr. Auflage, Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag. Sen, Alina et al. (1991): Quantitative Determination of ß-Damascenone in Foods Using a Stable Isotope Dilution Assay. J. Agric. Food Chem., 39, S. 757-759. Shaw, Philip und Charles W Wilson (1982): Volatile Sulfides in Headspace Gases of Fresh and Processed Citrus Juices. J. Agric. Food Chem., 30, S. 685-688. Sinclair, A et al. (1970): The Analysis of Volatile Sulphur Compounds in Beer. European Brewing Convention, Proceeding of the 12th Congress in Interlaken 1969, Amsterdam, London, New York: Elsevier Publishing Company, S. 427444. Spanier, Arthur M et al. (1994): Sulfur-Containing Flavor Compounds in Beef: Are They Really Present or Are They Artefakts? Aus: Sulfur Compounds in Foods. Mussinan, C und M Keelan [Hrsg.], ASC Symposium Series 564, S. 49-62. Spedding, DJ und P Raut (1982): The Influence of Dimethylsulphide and carbon disulphide in the bouquet of wines. Vitis, 21, S. 240-246. Steely, Jeffrey S (1994): Chemoluminescence Detection of sulfur Compounds in Cooked Milk. Aus: Sulfur Compouns in Foods. Mussinan, C und M Keelan [Hrsg.], ACS Symposium Series 564, S. 22-35. Steinegger, Ernst und Rudolf Hänsel (1988): Pharmakognosie. 4. Völlig neubearb. Aufl., Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. Steinegger, Ernst und Rudolf Hänsel (1992): Pharmakognosie. 5. korr. und durchgesehene Aufl., Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. Suomalien, Heiki und M. Lethonen (1980): Der Ursprung des Aromas in alkoholischen Getränken. Nahrung 24, 1, S. 49-61. Szelewski, M und J Hedrick (1997): Fragrance analysis using gas chromatography with atomic emission detection. SÖFW-Jounal, 123. Jahrgang, S. 592596. - 159 - Literaturverzeichnis Tamura, H et al. (1996): Characterisation of Citrus aroma Quality by Odor Threshold Values. Aus: Biotechnology for improved foods and flavors. Takeoka, Gary R et al. [Hrsg.], ASC Symposium Series 637, S. 282-294. Täufel, Alfred et al. (1993): Lebensmittellexikon, Hamburg: Behr´s...Verlag, 1993. Taurin, Luca (1996): A spectroscopic mechanism for Primary Olfactory Reception. Chemical Senses, 21, S. 773-791. Thorne, RSW et al. (1971): Control of sulphury impurities in Beer aroma. J. Inst. Brew., Vol. 77, S. 148-153. Tippmann, Marianne (1998): Vom Moleküle zum Gefühl. Pharmazeutische Zeitung PZ, 143. Jahrgang, Nr. 27, S. 59-60. Tressl, Roland et al. (1994): Formation of Sulfur-Containing Flavor Compounds from [13C]-Labeled Sugars, Cysteine and Methionine. Aus: Sulfur Compouns in Foods. Mussinan, C und M Keelan [Hrsg.], ACS Symposium Series 564, S. 224-235 Triqui, Reda und Gary A Reineccius (1995): Flavor Development in the Ripening of Anchovy (Engraulis encrasicholus L.). J. Agric. Food Chem., 43, S. 453-458. Ulrich, D (1999): Die menschliche Nase als gaschromatographischer Detektor. PEAKInfo, Hewlett Packard, Ausgabe 2. Van Haecht, JL und JP Dufour (1995): The Production of Sulfur Compounds by Brewing Yeast. Cerevisia and Biotechnology, 20 (1), S. 51-64. Voet, Donald und Judith Voet (1992): Biochemie. Weinheim: VCH-Verlag. von Kruedener, Stephanie et al. (1993): Arzneipflanzen, altbekannt und neu entdeckt. Berlin: Verlag H. Heenemann & Co. Wagner, H und L Sprinkmeyer (1973): Zur chromatographischen und spektroskopischen Analyse von Drogendestillaten. Arzneimittelforschung 23, Nr. 6, S. 749-755 Wichtl, Max (1989): Teedrogen. 2. Auflage, Stuttgart: Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft GmbH. Widder, Sabine (1998): Die Kombination sensorischer und instrumenteller Methoden zur Messung der Aromafreisetzung. DRAGOCO-Report, Nr. 3, Hameln: CW Niemeyer, S. 102 (101-111). Wittkowski, Reinhard (1987): Schnelle Qualitätskontrolle durch HeadspaceAnalysen. Aus: Schnellmethoden zur Beurteilung von Lebensmiteln und ihren Rohstoffen, Baltes, W [Hrsg.], Hamburg: Behr´s...Verlag, S. 110, (93 - 114). Wüstenfeld, H und Georg Haeseler (1964): Trinkbranntweine und Liköre, Herstellung, Untersuchung und Beschaffenheit, Berlin: Paul Parey. Zehentbauer, G und W Grosch (1997): Apparatus for quantitative headspace analysis of the characteristic odorants of baguettes, Z Lebensm Unters Forsch A, 205, S. 262-267. - 160 - Literaturverzeichnis Zervos, C und RH Albert (1992): Chemometrics: The use of multivariate methods for the determination and characterisation of off-Flavours. Aus: Off-Flavors in Food and Beverage, G. Charalambous [Hrsg.], Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V. Ziegler, Erich und Herta Ziegler (1998): Flavourings. Production, Compositions, Applications and Regulations, Weinheim: Wiley-VCH. - 161 - Literaturverzeichnis Lebenslauf Name Marc D. Lucas geboren 28. Januar 1971 in Berlin-Schmargendorf Schulische Ausbildung September 1976 – Juli 1977 Vorschule an der Ludwig-Heck-Grundschule, Berlin-Mariendorf September 1977 – Juli 1983 Ludwig-Heck-Grundschule August 1983 – Juni 1990 Askanisches Gymnasium, Berlin Tempelhof Juni 1990 Abitur Studium September 1990 – September 1992 Studium der Chemie und Botanik an der Technischen Universität Berlin. Oktober 1992 Diplom-Vorprüfung am Fachbereich Chemie der TU Berlin. Oktober 1992 – September 1994 Hauptstudium der Lebensmittelchemie am Fachbereich Lebensmittelwissenschaften der TU Berlin. November 1994 – 15. Januar 1995 Teil A der Hauptprüfung für Lebensmittelchemiker. 21. Januar 1995 – Juli 1995 Praktikant der Lebensmittelchemie, Analytik von Fumonisinen in Getreide im Arbeitskreis von Dr. R. Weber am Bundesinstitut für Veterinärmedizin und gesundheitlichen Verbraucherschutz (BgVV). August 1995 Werksvertrag am BgVV Untersuchung von Ochratoxin A in Kaffee. September 1995 - Februar 1996 Fertigarzneimittelprüfung, Entwicklung und Validierung von Analysenverfahren in der Abteilung für Qualitätssicherung der Firma Almed GmbH. März 1996 – Oktober 1996 Praktikum und Teil B der Hauptprüfung für Lebensmittelchemiker am Institut für Lebensmittel, Arzneimittel und Tierseuchen (ILAT) im Berliner Betrieb für Zentrale Gesundheitliche Aufgaben (BBGes) und am Staatliche Veterinär- und Lebensmitteluntersuchungsamt Potsdam. Berufliche Tätigkeiten November 1996 – Februar 1999 Mitarbeit bei der Nachzulassung von Arzneimitteln und bei der Produktneuentwicklung bei der Firma Divapharma-Knufinke GmbH, Beginn der Promotion. seit März 1999 Mitarbeit in der Qualitätssicherung im Bereich Rohstoffe bei der Firma Divapharma-Knufinke GmbH. - 162 -