Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-9554
For citation please use:
Main Title: Herstellung und Charakterisierung von antimykotisch wirksamen Peptiden aus der AFP-Familie der Ascomycota
Translated Title: Production and characterization of antifungal peptides from the AFP family of Ascomycota
Author(s): Paege, Norman
Advisor(s): Meyer, Vera
Jung, Sascha
Referee(s): Meyer, Vera
Mroginski, Maria Andrea
Steinem, Claudia
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: de
Abstract: Die sehr variable und große Gruppe der antimikrobiellen Peptide, von der mehr als 10.000 Vertreter in der Datenbank „Collection of anti-microbial peptids“ CAMPR3 [1] gelistet sind, steht schon lange als potenzielle Basis für Wirkstoffe im Fokus der Forschung. Es gibt auf Grund steigender Zahlen von Pilzinfektionen und Resistenzen gegen antimykotische Wirkstoffe ein großes Bedürfnis diese Quelle zu erschließen. Die Mitglieder der AFP-Familie sind auf Grund ihrer Spezies-Spezifität, besonders auch für bekannte human- und pflanzenpathogene Pilze mit hohem Bedrohungspotential, ohne bekannte Nebenwirkungen von Interesse. In dieser Arbeit wurden daher Grundlagen zur Etablierung des antimykotischen Proteins AFP aus A. giganteus ausgearbeitet. Dazu gehören (i) verbesserte Methoden zur Herstellung und Charakterisierung, (ii) die Charakterisierung des Wirk-Mechanismus und (iii) in silico Analysen zur Identifizierung der Mitglieder der AFP-Familie. Die Etablierung der Bioreaktorkultivierung, mit standardisierter Ausbeute von 10 mg/L Kulturmedium des AFPs, bildet den Anfang der Arbeit. Vom nativen Produzenten A. giganteus werden mehrere AFP-Varianten sekretiert, welche schwer voreinander zu trennen sind. Aus NMR Versuchen ergab sich, dass durch die sequenzielle Prozession zusätzlich zur längeren AFP Variante „lf“-AFP eine kürzere Variante, das „sf“-AFP (-Alanin), gebildet wird. Die heterologe Expression in P. pastoris ist daher der geeignetste Ansatz für die AFP Produktion, die homologe Herstellung in A. giganteus ermöglicht die Funktion anderer AFP-Varianten aufzuklären. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der C3-Sättigung von Glycosylceramiden auf die Wirksamkeit des AFPs untersucht. Die für Pilze eigenen Strukturmerkmale dieser Membranbestandteile können das spezifische Wirkspektrum des AFPs erklären. Es zeigte sich, dass die 2-Hydroxy Fettsäure N-Acyl-Δ3(E)-Desaturase für die Bildung der Doppelbindung zwischen dem dritten und vierten Kohlenstoffatom des Fettsäurerestes verantwortlich ist. Die Deletion dieses Enzyms führte zur Verringerung der Empfindlichkeit von A. niger oder F. graminearum gegen AFP. Die Expression des Enzyms in P. pastoris lässt einen AFP-sensitiven Stamm entstehen. Es konnte daher die Interaktion von AFP mit den Glycosylceramiden der pilzlichen Membran gezeigt werden. Im dritten Teil der Arbeit wurden Transkriptomdaten von A. niger, der ein anderes Mitglied der AFP-Familie, das AnAFP, sekretiert ausgewertet. Die Erstellung eines anafp-Ko-Expressionsnetzwerks ermöglichte die Zuordnung des AnAFP zu metabolischen Prozessen. Die in silico vorhergesagte Beteiligung des anafp wurde in Laborexperimenten überprüft, wodurch sie bestätigt werden konnte. Es fanden sich deutliche Hinweise für eine zellinterne Rolle des AnAFPs. Im letzten Teil der Arbeit konnten durch in silico Analysen über 50 AnAFP Orthologe in Ascomycota identifiziert werden. Hochkonserviert sind die Anzahl und Positionen der Cysteine sowie des „γ-cores“. Dabei handelt es sich um ein evolutionsbiologisch konserviertes dreidimensionales Strukturmotiv, welches Wechselwirkungen mit Membranen eingeht
The very variable and large group of antimicrobial peptides, of which more than 10,000 representatives are listed in the database "Collection of anti-microbial peptides" CAMPR3 [1], has long been in the focus of research as a potential basis for active substances. Due to the increasing number of fungal infections and resistance to antifungal agents, there is a great need to tap this source. The members of the AFP family are of interest due to their species-specificity, especially for known human and plant pathogenic fungi with high threat potential, without known side effects. Therefore, this work has provided the basis for establishing the antifungal protein AFP from A. giganteus. This includes (i) improved methods for production and characterization, (ii) characterization of the mechanism of action and (iii) in silico analyses to identify members of the AFP family. The establishment of bioreactor cultivation, with a standardized yield of 10 mg/L culture medium of AFP, is the beginning of the work. From the native producer A. giganteus several AFP variants are secreted, which are difficult to separate from each other. NMR experiments showed that the sequential procession produces a shorter variant, the "sf"-AFP (alanine), in addition to the longer AFP variant "lf"-AFP. Heterologous expression in P. pastoris is therefore the most suitable approach for AFP production. Homologous production in A. giganteus allows to elucidate the function of other AFP variants. In the second part of the work the influence of C3 saturation of glycosylceramides on the efficacy of AFP was investigated. The structural characteristics of these membrane components, which are specific to fungi, can explain the specific spectrum of activity of AFP. It was shown that the 2-hydroxy fatty acid N-acyl-Δ3(E)-desaturase is responsible for the formation of the double bond between the third and fourth carbon atom of the fatty acid residue. The deletion of this enzyme led to a reduction in the sensitivity of A. niger or F. graminearum to AFP. The expression of the enzyme in P. pastoris leads to the development of an AFP-sensitive strain. Therefore, the interaction of AFP with the glycosylceramides of the fungal membrane could be shown. In the third part of the work transcriptome data of A. niger, which secretes another member of the AFP family, AnAFP, were evaluated. The establishment of an anafp co-expression network enabled the assignment of AnAFP to metabolic processes. The in silico predicted involvement of anafp was verified in laboratory experiments, which confirmed it. There was clear evidence for a role of AnAFP in the cell. In the final part of the work, in silico analyses identified over 50 AnAFP orthologists in Ascomycota. Highly conserved are the number and positions of the cysteines and the "γ-core". This is an evolutionary-biologically conserved three-dimensional structural motif that interacts with membranes.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/10627
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-9554
Exam Date: 6-Dec-2019
Issue Date: 2020
Date Available: 21-Feb-2020
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): antimykotische Proteine
Glycosylceramide
AFP-Familie
Glucosylceramide
Bioreaktor
Chromatographie
antifungal peptide
Glucan
AFP
Pichia pastoris
Chitin
Aspergillus niger
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Appears in Collections:FG Angewandte und Molekulare Mikrobiologie » Publications

Files in This Item:
paege_norman.pdf
Format: Adobe PDF | Size: 9.18 MB
DownloadShow Preview
Thumbnail

Item Export Bar

This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons