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dc.contributor.advisorRappsilber, Juri-
dc.contributor.authorMüller, Fränze-
dc.date.accessioned2020-07-02T13:54:44Z-
dc.date.available2020-07-02T13:54:44Z-
dc.date.issued2020-
dc.identifier.urihttps://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/10921-
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.14279/depositonce-9814-
dc.description.abstractThe dynamics of protein structures are essential for cellular processes but are difficult to monitor by existing technologies. Crosslinking mass spectrometry (CLMS) can provide residue-resolution distance restraints, which may in principle be quantified to obtain unique insights into the structural flexibility of proteins. However, quantitative crosslinking mass spectrometry (QCLMS) needs to be established as a reproducible method before it can develop into a method of choice for studying protein dynamics. This requires the establishment and assessment of experimental workflows. My contributions to the development of QCLMS are presented in this cumulative thesis as four manuscripts: To assess the reproducibility of crosslinking data I first adapted the quantitation software Skyline, which required reformatting crosslinked peptides as linear peptides. Using bis[sulfosuccinimidyl] suberate (BS3)-crosslinked human serum albumin (HSA), I found QCLMS to have a similar reproducibility as general quantitative proteomics. However, in this workflow, quantitation was only possible on precursor level and matching quantitative crosslinked peptide information to residue pair information is error prone. (Müller et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2017) To further improve crosslink quantitation and simplify data processing, I switched to data-independent acquisition (DIA) and Spectronaut, as a leading DIA processing software. The DIA-QCLMS workflow improved the reproducibility of QCLMS, as was assessed using a mixture of seven BS3-crosslinked proteins and tolerated even very high sample complexity such as E. coli cell lysate as matrix. (Müller et al. Mol. Cell. Proteomics 2019) In combination with the photoactivatable crosslinker sulfosuccinimidyl 4,4’-azipentanoate (sulfo-SDA), the workflow was then extended to study conformational changes caused by environmental influences, that otherwise affect crosslink reaction activity. The photo-DIA-QCLMS workflow was used to study pH-induced conformation changes in HSA and cytochrome C as model systems and significantly widens the scope of potential scientific applications in quantitative crosslinking. (Müller et al. Anal. Chem. 2019) To make my developments of QCLMS accessible to a broad scientific user base, I prepared a detailed protocol. (Müller et al. submitted) In conclusion, through these developments and applications I have made substantial steps towards the implementation of QCLMS as a routine technology for the analysis of conformational dynamics of proteins and their complexes. Future technical developments in data analysis and detection of crosslinks may allow scaling this towards studying dynamic processes in more complex samples including organelles and whole cells.en
dc.description.abstractDie Dynamik von Proteinstrukturen ist für zelluläre Prozesse von wesentlicher Bedeutung, lässt sich jedoch mit vorhanden Technologien nur schwer erfassen. Crosslinking Massenspektrometrie (CLMS) liefert Distanz Informationen innerhalb eines Proteins auf Aminosäuren Ebene. Durch zusätzliche quantitative Experimente erhält man einen einzigartigen Blick in die strukturelle Flexibilität von Proteinen. Die quantitative crosslinking Massenspektrometrie (QCLMS) muss jedoch als reproduzierbare und nützliche Methode erst etabliert werden. Mein Beitrag zu diesem Thema wird in dieser kumulativen Doktorarbeit in vier Manuskripten vorgestellt: Um die Reproduzierbarkeit von crosslinking Daten beurteilen zu können, habe ich zunächst die prozessierung der peptide Daten an die Quantifizierungs-Software Skyline angepasst. Unter Verwendung von Bis[sulfosuccinimidyl] suberat (BS3) vernetztem Human Serum Albumin (HSA) stellte ich fest, dass QCLMS eine ähnliche Reproduzierbarkeit aufweist wie die allgemeine quantitative Proteomik. In diesem Arbeitsablauf war die Quantifizierung jedoch nur auf MS1-Ebene möglich, und die Zuordnung der quantitativen Informationen von vernetzten Peptiden zu nicht redundanten Peptid Paaren war fehleranfällig. (Müller et al. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2017) Um die Quantifizierung der crosslinking Daten weiter zu verbessern und die Datenverarbeitung zu vereinfachen, habe ich sowohl data independent-acquisition (DIA) als auch Spectronaut, eine führende DIA-Verarbeitungssoftware, für den neuen Arbeitsablauf verwendet. Der DIA-QCLMS-Workflow verbesserte die Reproduzierbarkeit von QCLMS, was anhand eines Gemisches aus sieben BS3-vernetzten Proteinen beurteilt wurde, und tolerierte auch komplexe Proben mit E. coli Zelllysat als Matrix. (Müller et al. Mol. Cell. Proteomics 2019) In Kombination mit dem photoaktiven Crosslinker Sulfosuccinimidyl 4,4’-azipentanoate (sulfo-SDA) wurde der Arbeitsablauf erweitert, um Konformationsänderungen von Proteinen durch wechselnde Umweltbedingungen untersuchen zu können. Der (photo)-DIA-QCLMS Arbeitsablauf wurde verwendet, um pH induzierte Konformationsänderungen der Modellsysteme HSA und Cytochrome C zu untersuchen. (Müller et al. Anal. Chem. 2019) Um die Entwicklungen in QCLMS einer breiten wissenschaftlichen Gemeinschaft zugänglich zu machen, habe ich ein detailliertes Protokoll erstellt. (Müller et al. Journal of Proteomics SI: Structural Proteomics 2019 submitted) Zusammenfassend ist festzuhalten, dass ich durch diese Weiterentwicklungen und Anwendungen wesentliche Schritte zur Implementierung von QCLMS als Standard Technologie zur Analyse dynamischer Konformationsänderungen von Proteinen und ihren Komplexen unternommen habe. Zukünftige technische Entwicklungen bei der Datenanalyse und beim Nachweis von Crosslinks könnten die Untersuchungen dynamische Prozesse in komplexeren Proben, einschließlich Organellen und ganzen Zellen, ermöglichen.de
dc.language.isoenen
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/en
dc.subject.ddc570 Biowissenschaften; Biologiede
dc.subject.othercrosslinking mass spectrometryen
dc.subject.otherquantitationen
dc.subject.otherlabel-freeen
dc.subject.otherData-Independent Acquisition (DIA)en
dc.subject.otherreproducibilityen
dc.subject.otherCrosslinking Massenspektrometriede
dc.subject.otherProteinstrukturende
dc.subject.otherLabel-freide
dc.subject.otherdatenunabhängige Erfassungde
dc.subject.otherReproduzierbarkeitde
dc.titleQuantitative crosslinking mass spectrometryen
dc.typeDoctoral Thesisen
tub.accessrights.dnbdomainen
tub.publisher.universityorinstitutionTechnische Universität Berlinen
dc.contributor.grantorTechnische Universität Berlinen
dc.contributor.refereeRappsilber, Juri-
dc.contributor.refereeRalser, Markus-
dc.date.accepted2019-09-23-
dc.title.subtitledevelopment and application to protein conformation changesen
dc.title.translatedQuantitative Crosslinking Massenspektrometriede
dc.title.translatedsubtitlevon Entwicklung und Anwendung zu Konformationsänderungen von Proteinende
dc.type.versionacceptedVersionen
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