Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-819
Main Title: Engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of L-glycerol 3-phosphate
Translated Title: Metabolic Engineering von Saccharomyces cerevisiae zur Produktion von L-Glycerol-3-phosphat
Author(s): Nguyen, Huyen Thi Thanh
Advisor(s): Nevoigt, Elke
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: L-G3P ist ein wichtiger Ausgangsstoff zur enzymatischen Synthese von Kohlenhydraten und Glycerophospholipiden, die als Therapeutika und Diagnostika verwendet werden können. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer biotechnologischen Methode zur Produktion von L G3P durch genetische Veränderung der Hefe S. cerevisiae. Die Vorteile dieser Methode gegenüber konventionellen enzymatischen und chemischen Methoden liegt in der selektiven Produktion des L-Enantioners und der Verwendbarkeit preiswerter, umweltfreundlicher Ausgangsstoffe wie Melassen. In der Hefe wird L-G3P durch Reduktion des glycolytischen Stoffwechselintermediats Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) gebildet. Dieser Schritt wird durch Glycerol-3-phosphat-Dehydrogenase (GPD) katalysiert. Das Enzym wird durch die zwei Isogene GPD1 und GPD2 codiert. L-G3P kann durch Glycerol-3-Phosphatase (GPP), die durch die Isogene GPP1 und GPP2 codiert wird, weiter zu Glycerol dephosphoryliert werden, oder dient als Ausgangsstoff zur Synthese von Lipiden. Der Einfluß der Aktivität von GPD und GPP auf die Akkumulation von L-G3P wurde hier untersucht. Unter aerobischen Bedingungen auf 2% Glucosemedium wurde die höchste Ausbeute an L-G3P (ca. 4.5 mg / g Trockengewicht) mit einem Stamm mit der Doppeldeletion gpp1?gpp2? und einem Plasmid zur Überexpression von gpd1 erzielt. Der Wildtyp produziert hingegen nur 0.17 mg L-G3P / g Trockengewicht. Interessanterweise wurde keine signifikante Änderung in der Lipidmenge und Zusammensetzung der Zellen beobachtet. Es ist bekannt, dass die Glycerolproduktion in S. cerevisiae unter osmotischem Streß und anaeroben Bedingungen stark erhöht ist. Im Stamm gpp1?gpp2?+GPD1 konnte die L-G3P-Menge durch Sauerstoffentzug stark gesteigert werden, während die Zugabe von 0.5M NaCl zum Medium trotz einer starken Induktion der GPD-Aktivit&au ;t keine signifikante Änderung der L-G3P-Menge bewirkte. Die Wirkung der Sauerstofflimitierung kann durch die erhöhte Verfügbarkeit von NADH für die GPD-Reaktion unter anaeroben Bedingungen erklärt werden. Die L-G3P-Konzentration konnte durch die Inhibition der Pyruvat-decarboxylase durch Deletion von PDC2, einem regulatorischen Gen, in gpp1?gpp2? weiter erhöht werden. Eine Reduktion der PDC-Aktivität führt zu einer Umleitung des Kohlenstoffflusses in Richtung L-G3P-Produktion und verhindert die Reoxidation von NADH als Cofaktor bei der Umwandlung von Acetaldehyd zu Ethanol. In der Tripelmutante gpp1?gpp2?pdc2? wurde GPP überexprimiert. Unter Sauerstoffauschluß akkumulierte der Stamm auf Glucosemedium ca. 17 mg L G3P / g Trockengewicht, ungefähr die hundertfache Menge des Wildtyps. Das Wachstum der Mutante auf Glucosemedium war allerdings stark beeinträchtigt, was eine industrielle Verwendung unmöglich macht. Der Stamm gpp1?gpp2?+GPD1 akkumuliert unter Sauerstofflimitiertung auf Glucosemedium bei akzeptabler Wachstumsrate (ca. 80% des Wildtyps) 16 mg L-G3P / g Trockengewicht und wurde daher für weitere Untersuchungen verwendet. Interessanterweise wurde in den späteren Phasen der Fermentation L-G3P auch im Medium gefunden. Die Gesamtmenge des L-G3P im Medium war gleich der intrazellulär gemessenen (jeweils ca. 13 mg / l Kulturmedium). Die Konzentration des extrazellulären L G3P war allerdings ca. 200fach geringer als die intrazelluläre Konzentration, da L G3P die Zellmembran nicht permeieren kann - nur ein kleiner Anteil wurde durch Autolyse von Zellen frei.
L-G3P can be used as a precursor for the enzymatic synthesis of carbohydrates and glycerophospholipids needed for therapeutics and diagnostics. The aim of this thesis was to develop a biotechnological method for production of L-G3P by using an engineered S. cerevisiae strain. The advantages of this method over the conventional enzymatic and chemical methods are the generation of the desired L-enantiomer of G3P and the use of cheap, environmentally sustainable, raw materials as molasses. In the yeast, L-G3P is produced by the reduction of the glycolytic intermediate dihydroxyacetone phosphate (DHAP). This step is catalysed by glycerol 3-phosphate dehydrogenase (GPD), an enzyme encoded by two isogenes (GPD1/ GPD2). L-G3P can be either further desphosphorylated to glycerol by glycerol 3-phosphatase (GPP) which is also encoded by two isogenes (GPP1/ GPP2) or used as precursor for the biosynthesis of lipids. Influence of the changes in GPD and GPP activity on the accumulation of L-G3P was investigated. Under aerobic conditions with 2% glucose medium, a strain in which both GPP1 and GPP2 were knocked out and GPD1 was overexpressed (gpp1?gpp2?+GPD1), accumulated the highest intracellular level of L-G3P (ca. 4.52 mg/g yeast dry weight) whereas the wild type only produced 0.17 mg L-G3P / g YDW. Interestingly, there was no remakable change in the lipid pattern of L-G3P overproducers in comparison to the wild type. It is known that glycerol production in S. cerevisiae is strongly induced under both osmotic stress and anaerobic conditions. The results showed that intracellular L-G3P accumulation in the strain gpp1?gpp2?+GPD1 could be indeed remarkably optimized by preventing oxygen supply while the addition of 0.5 M NaCl to the growth medium did not cause an obvious increase of L-G3P level, despite the dramatic increase of GPD activity. This could be explained by a higher availability of NADH for the nzymatic reaction catalysed by GPD under anoxic conditions. Accumulation of L-G3P was further improved by inhibiting of pyruvate decarboxylase activity by deleting PDC2 - a regulatory gene in the strain gpp1?gpp2?. The reduction of PDC activity could reroute the carbon flux toward L-G3P production and prevent the reoxidation of NADH in the reaction converting acetaldehyde to ethanol. GPD1 was overexpressed in the obtained triple mutant gpp1?gpp2?pdc2?. Under oxygen limited and in glucose medium, the strain gpp1?gpp2?pdc2?+GPD1 accumulated the highest amount of L-G3P (ca.17 mg/ g YDW), 100 times higher than that in the non-engineered wild type (see above). However, the growth of the PDC2 mutants on glucose was strongly defected. Therefore, it seems not possible to use this strain for the industrial application. The strain gpp1?gpp2?+GPD1 with an accumulation of about 16 mg L-G3P/ g YDW under oxygen limited conditions and an acceptable growth (about 80% of the wild type) on glucose was chosen as compromise for the further investigations and application. Interestingly, L-G3P was found in the culture supernatant at the later phase of fermentation with this strain. The total amount of extracellular L-G3P per litre was similar to that which was found intracellularly (about 13 mg/ l culture). However, the concentration of extracellular L-G3P was more than 200 times less than the intracellular L-G3P concentration, since the cell membrane is not permeable for L-G3P. Only a little amount was released to the medium by cell autolysis.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-7206
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1116
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-819
Exam Date: 22-Apr-2004
Issue Date: 28-Apr-2004
Date Available: 28-Apr-2004
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): L-Glycerol-3-Phosphat
Metabolic Engineering
Redoxgleichgewicht
Saccharomyces cerevisiae
L-Glycerol-3-phosphate
Metabolic engineering
Redox balance
Saccharomyces cerevisiae
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