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Main Title: Ansätze zur Optimierung der Glutathionausbeute in der Hefe Saccharomyces spp.
Translated Title: Approaches for optimization of glutathione yield in Saccharomyces spp.
Author(s): Lorenz, Eric
Advisor(s): Stahl, Ulf
Referee(s): Neubauer, Peter
Meyer, Vera
Popovic, Milan
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Has Part:
Language Code: de
Abstract: Glutathione is the most abundant non-protein thiol compound and tripeptide found in eukaryotes. The primary function of glutathione is to maintain the redox status and to protect the cell against oxidation caused by production of e.g. radicals or environmental influences. It is subject of different studies due to its physiological importance and industrial relevance. Based on its anti-oxidative characteristics, glutathione is used in many industrial areas e.g. pharmaceuticals and cosmetics. Additionally, for dietary supplement- and in food industry an increasing demand can be observed. To meet this demand, the available bioengineering technologies have to be optimized and raw materials should be used in a sustainable way. Furthermore, it is of high importance to reduce the manufacturing costs at all. This is fortified by low profit margins and high pressure on costs, which is a general challenge in microbial production processes. This thesis deals theoretically and practically with the bioprocessing optimization of glutathione production in Saccharomyces spp. and shows ways and possibilities how this can be achieved and what has to be considered. The theoretical part (chapter 1 & 2) of this thesis introduces the yeast and its applications in general. In the following course of introduction, the history, biosynthesis, physiological function, strategies for glutathione production, strain mutagenesis, -engineering and -selection of glutathione high producer is discussed. Additionally, the chapter 2 deepens and completes the knowledge in glutathione manufacturing and give an overview about the current patent situation and further glutathione applications. The practical part consists of three independent studies (chapter 3-5). For an efficient glutathione production, different contributing factors have to be considered. One is the choice of the right cultivation medium that depends also on later cultivation. Generally, for industrial application molasses is traditionally used as main carbon source. Molasses is the raw material of choice for yeast fermentation. It is an affordable byproduct which is produced during sugar production and it exists lot of experience to use molasses for breeding yeast in industrial application. However, molasses suspects seasonal fluctuations in terms of nutrient quality and composition. Therefore, for scientific studies it is preferable to use chemical-defined media and feeds. Chapter 3 addresses the approach how to design a chemical-defined medium systematically. Thereby the medium composition was based on the elemental composition of yeast. By applying a simplex centroid design, a combination of ammonium sulfate and chloride was identified to achieve higher biomasses and productivity. Furthermore, an optimal growth rate for glutathione production was detected by applying the so-called accelerated-stat (A-stat) process control strategy which is a derivation of traditional chemostat. Finally, all complex medium components like yeast extract and peptone could be successfully removed from the applied medium and feed without any disadvantages in growth and productivity. Generally, this CD-medium/feed setup is suitable for R&D purpose to cultivate Saccharomyces spp. efficiently. Another contributing factor especially in glutathione overproduction is the precursor respectively inducer for the glutathione biotransformation. In this context the most investigated component is the amino acid L-cysteine. In chapter 4, three different cysteine derivatives and their effect on glutathione yield were explored. To gather more data in a short time period a miniaturized and parallelized cultivation system, based on 50-mL shake tubes equipped with a gas-permeable membrane, was successfully applied for initial experiments. Due to the industrial relevance not only S. cerevisiae, but also the brewing yeast S. bayanus and the probiotic yeast S. boulardii was investigated in these studies. Finally, cysteine-ethyl-ester was found as highly efficient inducer for glutathione overproduction for all applied yeasts strains. It is assumed that due to its chemical properties cysteine-ethyl-ether can pass the yeast membrane more efficiently. The ratio between inducer and intracellular glutathione was more than 2 times compared to cysteine. In chapter 5 it was intented to emphasize the improvement of the cysteine/glutathione ratio (Ycys/GSH). Prior, a closed-loop-feedback-control strategy was developed to achieve an optimal feeding and ensure high biomasses. This feeding strategy is based on the evaluation of the respiratory quotient (RQ). Thereby an online RQ-controller is connected to a feeding pump and a balance, which monitores and collects data of the feeding amount. Once the fermentation process was finished a logistic regression model was chosen for fitting the resulted gravimetric values and to define a feeding regime. After the implementation of the feeding scheme, the Ycys/GSH ratio had to be optimized. For this purpose, different time-points for cysteine addition, the mode of addition (bolus/continuous) and the concentration were studied. The highest Ycys/GSH ratio (0.54 mol/mol) was obtained when cysteine is added during the late growth phase and in small proportions continuously. Additionally, this approach resulted in a glutathione concentration of 1650 mg/L and biomass of about 99.5 g/L which corresponds to 1.76% intracellular glutathione content. The results could be successfully transferred into a 150-L pilot scale bioreactor. Through a combination of the optimized cysteine addition strategy and Repeated-Fed-Batch approach the space-time-yield was further improved which could be of high relevance for industrial production. In the last chapter 6, the gained results and findings are put and discussed in the context to economic perspectives. A traditional baker's yeast production is used as comparative example. Further, the main cost drivers for an industrial glutathione production process in yeast are considered. In particular, this includes the costs of raw materials, energy, personnel process water and the costs of disposals. In addition, methods for processing glutathione enriched yeasts are discussed. Here the final application often decides about the choice of the processing method. It has to be differentiated between glutathione yeast-derived products and glutathione as bulk chemical. Some of these applications and their manufacturer are mentioned. Finally, it can be stated that the global demand for glutathione will be further increase in all industrial sectors. In parallel, raw material costs becoming constantly higher. Therefore, an efficient, sustainable and responsible management with resources moving into the spotlight. This thesis gives thought-provoking impulses and shows potential solutions to overcome the increasing demand of glutathione and related products.
Glutathion (GSH) ist die am häufigsten vorkommende nicht-proteingebundene Thiolverbindung in Eukaryonten. Die primäre intrazelluläre Funktion von GSH ist es, den Redoxstatus aufrecht zu erhalten und die Zelle vor Oxidationsreaktionen ausgelöst durch z.B. Radikale oder Umwelteinflüsse zu schützen. Nicht nur die physiologische Bedeutung in der Zelle, sondern auch seine industrielle Relevanz machen GSH zum Forschungsgegenstand vieler Studien. Aufgrund seiner antioxidativen Eigenschaften wird GSH in vielen Bereichen industriell genutzt, wie der pharmazeutischen- und kosmetischen Industrie. Aber auch in der Lebensmittelindustrie oder als Nahrungsergänzungsmittel steigt der Bedarf an GSH. Diese Arbeit befasst sich theoretisch und praktisch mit der bioverfahrenstechnischen Optimierung der GSH-Produktion in Saccharomyces spp. und zeigt Wege und Möglichkeiten als auch Lösungsansätze auf. Der theoretische Teil der Arbeit (Kapitel 1 & 2) ist die Einleitung in das Thema Hefe und zeigt, wie vielseitig Hefe eingesetzt werden kann. Darunter fällt auch GSH, wobei im weiteren Verlauf auf die Historie, Biosynthese und physiologische Funktion eingegangen wird. Auch auf Strategien zur GSH-Produktion und auf die derzeitige Patentsituation wird eingegangen. Der praktische Teil der Arbeit besteht aus 3 unabhängigen Studien mit Fokus auf dem Kultivierungsmedium, dem GSH Induktor sowie der Prozessführung. Für eine effiziente GSH-Produktion ist die Wahl des geeigneten Kultivierungsmediums, unter Berücksichtigung der späteren Anwendung, entscheidend. Bei der industriellen Produktion werden meist Komplexrohstoffe wie Melasse verwendet. Jedoch ist die Melassequalität und Zusammensetzung saisonalen Schwankungen unterworfen. In wissenschaftlichen Studien können diese Qualitätsunterschiede zu erhöhter Prozessvariabilität führen. Deshalb wird, wenn möglich, bevorzugt auf chemisch-definierte (CD) Medien und Feeds zurückgegriffen. In Kapitel 3 wird die Entwicklung eines CD-Mediums/Feeds erläuert. Als Ausgangspunkt für ein CD-Medium diente die elementare Zusammensetzung der Hefe S. cerevisiae. Dabei konnte als ideale Stickstoffquelle eine Kombination aus (NH4)2SO4 und NH4Cl gefunden werden, um hohe Biomassen zu erzielen. Für eine verbesserte GSH-Produktivität wurde die Wachstumsrate angepasst. Hierfür wurde eine Ableitung des Chemostats, der sog. A-Stat, verwendet. Schlussendlich konnten alle nicht chemisch definierten Medienkomponenten entfernt bzw. ersetzt werden, ohne Einbußen in der Biomasse- und Produktbildung zu verzeichnen. Ein ebenso wichtiger Faktor wie das Nährmedium ist die Substanz, welche als Vorstufe oder Präkusor für die Biotransformation zu GSH dient und diese gleichzeitig induziert (hier als Induktor bezeichnet). In Kapitel 4 werden neben Cystein noch 3 weitere Substanzen auf ihre Fähigkeit hin untersucht, die GSH Biosynthese zu induzieren. Dazu wurden 50mL Kultivierungsröhrchen verwendet, welche mit einer gaspermeablen Membran ausgerüstet waren. Aufgrund der industriellen Relevanz wurden die Untersuchungen auch mit anderen Hefestämmen wie der Brauhefe S. bayanus und der probiotischen Hefe S. boulardii durchgeführt. Am Ende konnte für alle verwendeten Hefestämme gezeigt werden, dass Cystein-Ethyl-Ester ein hoch effizienter Induktor/Präkursor ist. Es wird vermutet, dass die chemischen Eigenschaften Cystein-Ethyl-Ester befähigen, leichter die Membran zu passieren. Auch konnte gezeigt werden, dass im Vergleich zu Cystein das Verhältnis zwischen Induktor und intrazellulärer GSH-Konzentration um mehr als Faktor 2 erhöht wird. Die Prozesssteuerung und -optimierung trägt im hohen Maße zur Gesamtwirtschaftlichkeit bei. In Kapitel 5 lag der Fokus auf der Optimierung des Verhältnisses zwischen eingesetztem Cystein und produziertem GSH (Ycys/GSH). Zuvor wurde jedoch ein Fed-Batch Verfahren entwickelt, welches hohe Biomassen garantiert. Hierzu wurde mit Hilfe einer Abgasanalyse der respiratorische Quotient (RQ) berechnet. Dieser diente zur Steuerung einer Fütterungspumpe, mit der ein geschlossener, selbst steuernder Regelkreis realisiert wurde. Die sich daraus ergebenen Fütterungsmengen wurden per Waage und Prozessleitsystem aufgezeichnet und konnten mit einem logistischen Regressionsmodel beschrieben werden. Daraus ergab sich ein Fütterungsprofil, welches im weiteren Verlauf der Studie verwendet wurde. Zur Optimierung des Ycys/GSH Ratios wurden unterschiedliche Cystein-Zugabezeitpunkte, der Zugabemodus (dis-/kontinuierlich) und die Cysteinkonzentration untersucht. Dabei wurde das höchste Ycys/GSH Ratio von 0.54 mol/mol erhalten, wenn Cystein in der späten Wachstumsphase und in kleinen Mengen kontinuierlich zugefüttert wird. Dieses Setup resultierte in einer GSH-Konzentration von 1650 mg/L bzw. 1.76% bei einer Biomasse von 99.5 g/L. Diese Prozessstrategie wurde erfolgreich vom Labormaßstab (5-L) in den Pilotmaßstab (150-L) übertragen. Durch Kombination der optimierten Zugabe des Präkusors Cystein und des Repeated-Fed-Batch Modus konnte die Raum-Zeit-Ausbeute signifikant erhöht werden. Im letzten Teil der Arbeit werden die oben beschriebenen Ergebnisse in einen wirtschaftlichen Kontext gebracht und es wird aufgezeigt, welche Faktoren die Prozessökonomie beeinflussen können. Als Modellbeispiel diente eine traditionelle Backhefeproduktion. Die Hauptkostentreiber sind die Aufwendungen für Rohmaterialien, Energie, Prozesswasser und Entsorgungskosten. Auch wird Bezug genommen auf die Aufarbeitung der angereicherten GSH-Hefen und wie diese durch die Anwendung beeinflusst wird. Die Herausforderungen an eine nachhaltige Produktion von GSH werden weiter steigen wie auch die weltweite Nachfrage. Um diesen Bedarf decken zu können, müssen die vorhandenen bioprozesstechnischen Verfahren optimiert werden. Generell unterliegen mikrobielle Produktionsprozesse einem hohen Preisdruck, weil die Gewinnmargen klein und die Prozesskosten hoch sind. Gerade die Kosten für Rohstoffe und Energie werden zukünftig stetig ansteigen. Deshalb wird das Interesse an einer effizienten, nachhaltigen und verantwortungsvollen Nutzung der vorhandenen Ressourcen weiter in den Fokus rücken. Diese Arbeit zeigt bioprozesstechnische Lösungsansätze auf, um die zukünftige Nachfrage an GSH und assoziierten Produkten decken zu können.
Exam Date: 5-Feb-2020
Issue Date: 5-Feb-2020
Date Available: 24-Jun-2020
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): glutathione
bioprocess engineering
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