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Main Title: Konjugativer DNA Transfer zwischen Gram-positiven und Gram-negativen Spezies
Subtitle: Transferkomponenten des Multiresistenzplasmids pIP501 aus Streptococcus agalactiae
Translated Title: Conjugative DNA transfer between Gram-positive and Gram-negative species
Translated Subtitle: transfer components of the multiresistance plasmid pIP501 from Streptococcus agalactiae
Author(s): Kurenbach, Brigitta
Advisor(s): Grohmann, Elisabeth
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Das konjugative Resistenzplasmid pIP501 gehört zur Inkompatibilitätsgruppe Inc18 und weist einen breiten Wirtsbereich in Gram-positiven Bakterien auf, zu denen humanpathogene Keime sowie biotechnologisch relevante Spezies gehören. Seine Größe beträgt 30.599 bp, und es enthält 32 offene Leserahmen mit einer Größe von mehr als 90 AS. Mittels Kreuzungsversuchen auf halbfesten Oberflächen konnte konjugativer Transfer von pIP501 von Enterococcus faecalis sowohl nach Streptomyces lividans als auch nach Escherichia coli gezeigt werden. Replikations-, Resistenz- und Transferfaktoren sind in beiden neuen Wirten funktionell. Dies ist der erste Nachweis konjugativen Transfers eines natürlich vorkommenden Plasmids zwischen diesen Organismen. Die Sequenzierung des bisher unbekannten Abschnitts von pIP501 stromabwärts von orf6 der Transfer (tra)-Region zeigte das Vorhandensein von neun weiteren offenen Leserahmen (orf7-orf15). Die Genprodukte Orf5, Orf7 und Orf10 zeigen Ähnlichkeiten mit Komponenten von Typ VI Sekretionssystemen. Das sich orf15 anschließende Gen ist der Copy-Number Repressor copR. Mit 15,07 kb umfasst die tra-Region fast die Hälfte des gesamten Plasmids, dessen Gesamtsequenz mit Hilfe der neuen Daten assembliert werden konnte. Mittels RT-PCR konnte gezeigt werden, dass die tra-Region eine transkriptionelle Einheit darstellt. Ein putativer rho-unabhängiger Terminator stromabwärts von orf15 wurde postuliert, die Transkription endet mit orf15. Der Transkriptionsstartpunkt der tra-Region liegt etwa 120 bp stromaufwärts des putativen Startcodons von orf1 innerhalb des oriT. Der abgeleitete Promotor Ptra überlappt teilweise mit benachbarten inverted repeat Strukturen. Zusammengenommen ergeben diese Daten einen extrem kompakten Aufbau von oriT/Ptra, welcher auf eine negative Autoregulierung der Region durch die von orf1 codierte TraA DNA-Relaxase hinweisen könnte. Semi-quantitative RT-PCR wurden durchgeführt, um den Einfluss der Zelldichte auf die Regulation des tra-Operons zu untersuchen. Unter den untersuchten Bedingungen ist die Regulation wachstumsphasenunabhängig. Die postulierte Relaxase-Funktion von TraA wurde in vitro bewiesen. TraA (662 AS) und ein verkürztes Protein TraA293, das die N-terminalen 293 AS von TraA umfasst, wurden in in vitro Cleavage Assays eingesetzt und bezüglich ihres Temperaturoptimums sowie der Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen charakterisiert. TraA ist das einzige Protein, das für die Nicking-Aktivität an oriT in vivo und in vitro notwendig ist.
The conjugative resistance plasmid pIP501 belongs to incompatibility group Inc18 and shows a broad host range within Gram-positive bacteria, among which human pathogens as well as biotechnologically relevant species are found. With a size of 30,599 bp, it contains 32 open reading frames of 90 or more aminoacids. Conjugative transfer of pIP501 from Enterococcus faecalis to Streptomyces lividans and to Escherichia coli was shown by solid surface ( filter ) matings. Replication, resistance and transfer factors were functional in the new hosts. This is the first demonstration of conjugative transfer of a naturally occurring plasmid between these organisms. Sequence determination of the previously unknown part of pIP501 downstream of orf6 of the transfer (tra)-region revealed the presence of nine further open reading frames (orf7 orf15). The gene products Orf5, Orf7 and Orf10 show identities with components of type IV secretion systems. The gene following orf15 is the copy number repressor copR. With a size of 15.07 kb, the tra-region comprises almost half of the plasmid. The complete pIP051 plasmid sequence could be assembled by use of the new data. RT-PCR showed that the tra-region is a transcriptional unit. A putative rho-independent terminator was postulated, transcription ends with orf15. The transcriptional start of the tra-region is situated about 120 bp upstream of the putative startcodon of orf1 within oriT. The deduced promoter Ptra overlaps with parts of inverted repeat sequences located in this area. Taken together these data show an extremely compact structure of oriT/Ptra, which makes negative autoregulation of the tra-operon by orf1-encoded TraA DNA relaxase likely. Semi-quantitative RT-PCR was used to examine the influence of cell density on the regulation of the tra-operon. Under the investigated conditions the regulation was independent on the growth phase. The postulated DNA relaxase function of TraA was proven in vitro. TraA (662 aminoacids) and a C-terminally truncated protein TraA293 comprising the N-terminal 293 aminoacids were used in in vitro cleavage assays and thereby the optimum temperature and the dependence on divalent cations were determined. TraA is the only protein required for nicking at oriT.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-7522
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1148
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-851
Exam Date: 24-May-2004
Issue Date: 11-Jun-2004
Date Available: 11-Jun-2004
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Breiter Wirtsbereich
Konjugativer Transfer
PIP501
Plasmid
Regulation
Relaxase
Transfer
Typ IV Sekretion
Broad host range
Conjugative transfer transfer
PIP501
Plasmid
Regulation
Relaxase
Type IV secretion
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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