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Main Title: Decoding the metabolic program of deregulated MYCN expression in neuroblastoma
Translated Title: Analyse der metabolischen Regulation in Abhängigkeit von MYCN im Neuroblastom
Author(s): Arlt, Birte
Advisor(s): Deubzer, Hedwig
Kempa, Stefan
Referee(s): Lauster, Roland
Deubzer, Hedwig
Rappsilber, Juri
Eggert, Angelika
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: The oncogene MYCN is amplified in approximately 22% of all neuroblastomas and correlates with aggressive disease and unfavorable patient survival. Directly targeting MYCN remains a challenge due to its biochemical structure. We aimed for a deeper understanding of key metabolic pathways associated to amplified MYCN to discover druggable nodes that can be directly targeted for high-risk neuroblastoma therapy. We performed GC-MS and LC-MS based methodologies for quantitative analysis of metabolites and proteins within the central carbon metabolism (CCM). Pulsed stable isotope-resolved metabolomics experiments (pSIRM) enabled the monitoring of glucose-derived carbons through the CCM. In order to decipher MYCN-dependent changes in the metabolic network, we quantified the proteome of a representative cohort of primary neuroblastoma biopsies and neuroblastoma cell lines by performing shotgun proteomics. High-level MYCN expression strongly correlated with the expression of proteins within the de novo serine synthesis pathway and the one-carbon metabolism. We identified phosphoglycerate dehydrogenase (PHGDH), the rate-limiting enzyme in de novo serine synthesis, as a metabolic target of MYCN. High-level PHGDH expression correlated with amplified MYCN on transcriptional and translational level in vitro. We observed a recruitment of MYCN to two different regions within the PHGDH promoter site by applying ChIP qRT-PCR, indicating a MYCN-mediated transcriptional regulation of PHGDH in neuroblastoma cells. Further, we have shown by pSIRM experiments that glucose-derived carbon routing through de novo serine synthesis is enhanced in MYCN-amplified compared to MYCN non-amplified cells. Serine and glycine starvation of MYCN-amplified cells did not affect proliferation and nucleotide pools, arguing for an independence of these cells to exogenous serine and glycine supply. This starvation induced PHGDH protein expression and enhanced de novo serine synthesis in MYCN non-amplified cells. However, proliferation was arrested and nucleotide pools were diminished in these cells. We constructed PHGDH knockout clones by the CRISPR/Cas9 technology to genetically inhibit PHGDH expression in vitro. Proliferation of these clones was significantly decreased compared to the MYCN-amplified control cells. Pharmacological suppression of PHGDH activity with two small molecule inhibitors arrested proliferation in MYCN-amplified and MYCN non-amplified neuroblastoma cells in vitro. In-vivo PHGDH suppression in mice carrying a patient-derived MYCN-amplified neuroblastoma xenograft hindered initial tumor growth which relapsed in later stages. A combination treatment of PHGDH inhibition with the chemotherapeutic drug cisplatin even induced an antagonizing effect on chemotherapy efficacy in vivo. In addition, we performed pSIRM experiments in vitro and observed a rerouting of glucose-derived carbons within the central carbon metabolism by PHGDH inhibition which will be further investigated. Moreover, we found evidence that glutamine starvation disrupted the MYCN-mediated regulation of PHGDH in neuroblastoma cells. Antifolates targeting the one-carbon metabolism reduced proliferation more efficiently compared to PHGDH inhibitors in vitro. This observation was accompanied by a significant decrease in nucleotide levels in MYCN-amplified and MYCN non-amplified cells. The herein presented thesis provides novel insights in the regulation of the de novo serine synthesis pathway and the one-carbon metabolism in neuroblastoma. We identified PHGDH as a promising target in dependency of MYCN expression. However, PHGDH inhibition did not induce lethal effects in neuroblastoma cells in in vitro and in vivo experiments. Thus additional research is needed to further exploit the application of small compounds targeting de novo serine synthesis and the one-carbon metabolism for the development of novel therapeutic strategies.
Das Neuroblastom ist eine bösartige Krebserkrankung des sympathischen Nervensystems, die vor allem im frühen Kindesalter auftritt. In circa 22 Prozent aller Fälle liegt eine Amplifizierung des Onkogens MYCN vor, welche oft mit einer aggressiven Tumorbiologie und niedrigen Überlebensraten assoziiert ist. Die Anwendung von niedermolekularen Inhibitoren als Therapeutikum ist aufgrund der biochemischen Struktur des Onkogens wenig geeignet. Aus diesem Grund untersucht die vorliegende Arbeit MYCN-abhängige Stoffwechselwege mit dem Ziel direkte Angriffspunkte für neue Therapieformen zu identifizieren. Die Anwendung von Massenspektrometrie-basierter Methoden (GC-MS / LC-MS) ermöglichte die Quantifizierung von Metaboliten und Proteinen des zentralen Kohlenstoffwechsels. Dieser ist ein wesentlicher Produzent notwendiger zellulärer Bausteine wie Aminosäuren und Nukleotide, die zur Erhaltung der energetischen Homöostase und damit zum Zellwachstum beitragen. Zusätzlich ermöglichten Markierungsexperimente unter Anwendung von stabilen Isotopen (pSIRM) die quantitative Betrachtung der Stoffwechselaktivität sowie deren Regulation. Ein Vergleich der Proteinexpressionen zwischen etablierten Zellkulturmodellen des Neuroblastoms und einer repräsentativen Kohorte primärer Biopsien von Neuroblastom-Patienten ergab eine direkte Korrelation zwischen MYCN-Status und der Expression der Enzyme der Serin-Synthese und des 'one-carbon'-Stoffwechsels. Basierend auf dieser Analyse identifizierten wir das Enzym Phosphoglyzeratdehydrogenase (PHGDH), welches den ersten Schritt der Serin-Synthese katalysiert, als metabolisches Target. In in vitro Experimenten zeigten wir, dass eine hohe Expression von PHGDH mit einer MYCN Amplifikation auf transkriptioneller und translationaler Ebene korreliert. Mittels ChIP qRT-PCR wiesen wir die Anwesenheit von MYCN in zwei Bereichen der PHGDH Promoterregion nach. Weiterhin konnten wir einen erhöhten Umsatz von Glukose in der de novo Synthese der Aminosäure Serin in MYCN-amplifizierten Neuroblastomzelllinien aufzeigen. Die Wegnahme von Serin und Glycin, ein weiteres Substrat des Stoffwechselweges, im Zellkulturmedium zeigten keinen Effekt auf die Proliferation und Nukleotidlevel in MYCN-amplifizierten Zellen. Dagegen stellten wir in MYCN nicht-amplifizierten Zellen eine signifikante Erhöhung der PHGDH-Expression, sowie der Stoffwechselaktivität des de novo Serin-Syntheseweges fest. Gleichzeitig waren das Zellwachstum und die Nukleotidsynthese stark beeinträchtigt. In weiterführenden Analysen hemmten wir PHGDH mittels genetischer Modifikation und pharmakologischer Intervention. Zunächst erzeugten wir mittels der CRISPR/Cas9-Technologie PHGDH knockout Klone. Diese zeigten ein verlangsamtes Wachstum im Vergleich zu den MYCN-amplifizierten Kontrollzellen in vitro. Im nächsten Schritt inhibierten wir PHGDH mit niedermolekularen Inhibitoren in Neuroblastom-Zelllinien und beobachteten einen Rückgang der Proliferation. Die PHGDH Inhibitorbehandlung von Mäusen mit Neuroblastom-Xenotransplantaten verlangsamte das initiale Tumorwachstum, welches jedoch über die Dauer der Behandlung wieder zunahm. Weiterführende in vivo Kombinationsbehandlungen der PHGDH Inhibitoren mit dem Zytostatikum Cisplatin zeigten sogar einen antagonistischen Effekt auf die Cisplatin-Effizienz. In vitro durchgeführte pSIRM Experimente gaben uns Hinweise auf eine veränderte Glukose-Verstoffwechselung im zentralen Kohlenstoffwechsel unter PHGDH Inhibition. Diese Beobachtung wird in weiterführenden Analysen eruiert. Darüber hinaus beobachteten wir, dass Glutaminmangel in die MYCN-abhängige Regulation von PHGDH in Neuroblastom-Zellen intervenierte. Wir behandelten Neuroblastom-Zellen mit Antifolaten, die Enzyme des 'one-carbon'-Stoffwechsels inhibieren. Im Vergleich zur Behandlung mit PHGDH Inhibitoren zeigten diese einen verstärkten inhibitorischen Effekt auf das Wachstum und eine Verringerung der Nukleotidlevel in MYCN-amplifizierten und MYCN nicht-amplifizierten Zellen in vitro. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass die de novo Serin-Synthese und der 'one-carbon'-Stoffwechsel eine signifikante Relevanz für MYCN-amplifizierte Neuroblastom-Zellen hat. Unsere Erkenntnisse ermöglichten neue Einblicke in die Regulation der de novo Serin-Synthese im Neuroblastom und identifizierten PHGDH als vielversprechendes Target dieses Stoffwechselweges. Jedoch induzierte eine PHGDH Inhibition keine letalen Effekte in Neuroblastom-Zellen. Weiterführende Forschung ist daher unabdingbar um die Bedeutung der de novo Serin-Synthese und des 'one-carbon'-Stoffwechsels für therapeutische Zwecke zu nutzen.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/11523
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-10407
Exam Date: 10-Mar-2020
Issue Date: 2020
Date Available: 30-Jul-2020
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): cancer cell metabolism
de novo serine synthesis
one-carbon metabolism
neuroblastoma
MYCN
Neuroblastom
de novo Serin-Synthese
zentraler Kohlenstoffwechsel
Tumor-Metabolom
License: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
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