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Main Title: Effects of micropollutants on the Panke River microbial communities and degradation of selected pharmaceuticals by manganese-oxidizing bacteria
Translated Title: Auswirkungen von Spurenstoffen auf die mikrobiellen Gemeinschaften im Fluss Panke und Abbau ausgewählter Arzneimittel durch Mangan-oxidierende Bakterien
Author(s): Nega, Marcella
Advisor(s): Szewzyk, Ulrich
Referee(s): Szewzyk, Ulrich
Farnleitner, Andreas
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
References: 10.3390/w11050888
Language Code: en
Abstract: Pharmaceuticals and other anthropogenic substances are detectable worldwide in trace concentrations in surface waters since they are only partially retained in wastewater treatment plants (WWTPs). In metropolitan areas, high consumption rates of pharmaceuticals can induce an increase of organic compounds in surface waters, and these biologically active compounds can be a burden to aquatic environments. Illumina MiSeq 16S rRNA gene amplicon sequencing was performed in two sampling campaigns (October 2016 and June 2017) to analyze sediment biofilm populations in the Panke River in Berlin. Multiple sediment cores were sampled at three sampling sites, whereas two sampling sites were located upstream of the WWTP effluent inflow and one sampling site downstream. Sequencing data were processed to depict sediment’s microbial community pattern in the Panke. Results of the bacterial 16S rRNA gene amplicons revealed Nitrospirae, Proteobacteria, Chloroflexi, Actinobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, and Ignavibacteriae as the most abundant operational taxonomy unit (OTU) representatives. The further physicochemical analysis revealed significantly higher dissolved organic carbon (DOC) concentrations from 6.55 mg L-1 up to 8.82 mg L-1 downstream of the WWTP effluents in the Panke River. Nitrate concentrations up to 38.3 mg L-1 indicated pollution from NO3- containing sources downstream of WWTP effluents. Micropollutants were found downstream of WWTP effluents in higher concentrations, whereas more than 25 different compounds were identified during both sampling campaigns. Highest concentrations were found with acesulfame, gabapentin, diclofenac, carbamazepine11-dihydroxy-10, 11-dihydro-carbamazepine (DHCBZ), carbamazepine, clofibric acid, and bezafibrate were detected between 1800 to 100 μg L-1. Biostatistical analyses were used to evaluate the impact of various environmental factors, such as micropollutants, on the sediment’s microbial communities. Significant changes in the alpha- and beta diversity correlated with sulfate (SO4 2-), which did not originate from WWTP effluents. Sulfate can originate from different sources such as sedimentary deposits (e.g., open-pit mines and pyrite oxidation) or agricultural sources. The study findings revealed that WWTP effluents did not govern significant changes in microbial communities and that causal observation cannot be proven. Overall, it is more likely that further unobserved factors play a role in affecting the biofilm community's composition, which was, in that case, not covered by the study design. Further laboratory experiments with manganese-oxidizing bacteria (MOB) showed diclofenac (DCF) degradation, whereas no degradation was observed in experiments with carbamazepine and gabapentin. Three MOB strains (two Alphaproteobacteria and one Gammaproteobacteria) revealed significant DCF removal rates in two different media with different manganese sources (manganese carbonate (MnCO3 17 mM) or manganese sulfate (MnSO4, 0.3 mM)), and various amount of carbon source (yeast extract: 1 g L-1 or 0.1 g L-1). DCF removal rates differ between MOB strains Ideonella sp. A288 and Pseudomonas sp. OF001, whereas approximately 19 μg L-1 d-1 of DCF was degraded by Ideonella sp. A288 and up to 200 μg L-1 d-1 by Pseudomonas sp. OF001. However, Ideonella sp. A288 and Pseudomonas sp. OF001 did not show significant differences in DCF removal rates in biodegradation experiments with MnCO3 or MnSO4 as a manganese source. Removal rates with various manganese source only differed in experiments with Comamonadaceae bacterium A210, and higher DCF removal rates in LSM2 medium with MnCO3 and higher carbon content (1 g L-1) were observed. Further experiments with biologically produced manganese oxides (BioMnOx) and without active cells showed that degradation of DCF was not induced. Therefore, it was shown that biologically active cells were needed for DCF degradation. In LC-MS-QToF analysis, primary DCF transformation products were detected in degradation experiments with Pseudomonas sp. OF001. Interestingly, differences were observed during degradation of DCF by Pseudomonas sp. OF001 in 803b medium (MnSO4, low carbon content) and LSM2 medium (MnCO3, high carbon content). 4'-hydroxy-diclofenac was detected as the major metabolite in 803b medium – further degradation experiments with Pseudomonas sp. OF001 showed a depletion of the aromatic ring structure of DCF, which might indicate a ring-opening of the compound in the UV-vis spectra. Degradation experiments showed that MOB strains were able to degrade DCF. However, the biologically active degradation differed between MOB strains, and the medium content also played a crucial role in the DCF degradation by certain MOB. Furthermore, due to the availability of the genome information of Ideonella sp. A288, it is speculated that a multicopper oxidase which is harbored in the genome might be involved in the Mn(II) oxidation. Still, further experiments are needed to prove this hypothesis.
Arzneimittel und andere anthropogene Stoffe sind in Spurenkonzentrationen weltweit in Oberflächengewässern nachweisbar, da diese in Kläranlagen nicht vollständig entfernt werden können. Insbesondere in Großstädten und urbanen Ballungsgebieten kann ein hoher Arzneimittelverbrauch zum Anstieg organischer Spurenstoffe in den Oberflächengewässern führen, wobei diese durch ihre biologische Aktivität eine weitere Belastung in der aquatischen Umwelt darstellen können. In der vorliegenden Arbeit wurde die Biofilmpopulation in den Sedimenten der Panke während zwei Probenahmekampagnen (Oktober 2016 und Juni 2017) mittels der Illumina MiSeq 16S rRNA Sequenzierung analysiert. Dabei war eine der drei Probenahmestellen vom Klarwasserzulauf einer Kläranlage beeinflusst, die durch den Buchholzer Graben in die Panke eingeleitet wurde. Durch die gewonnenen Sequenzierungsdaten konnte die Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften dargestellt werden. Die Ergebnisse der 16S rRNA-Genamplikons zeigten auf, dass die Abundanz spezifischer OTUs wie etwa der Nitrospirae, Proteobakterien, Chloroflexi, Aktinobakterien, Acidobakterien, Bacteroidetes und Ignavibakterien am höchsten war. Die Konzentration am gelösten organischen Kohlenstoff (DOC) lag zwischen 6,55 mg L-1 und 8,82 mg L-1 stromabwärts des Zulaufs der Kläranlage und war signifikant höher als die DOC-Werte an den anderen Probenahmestellen. Ebenfalls wurden stromabwärts erhöhte Nitratkonzentrationen (NO3) von bis zu 38,3 mg L-1 detektiert, die durch Verunreinigungen aus NO3-haltigen Quellen zu erklären waren. Insgesamt wurden mehr als 25 verschiedene Verbindungen detektiert, wobei mit Werten von 1800 μg L-1 bis 100 μg L-1 stromabwärts die höchsten Spurenkonzentrationen bei Acesulfam, Gabapentin, Diclofenac, Carbamazepin 11-dihydroxy-10, 11-Dihydrocarbamazepin (DHCBZ), Carbamazepin, Clofibrinsäure und Bezafibrat nachgewiesen wurden. Durch die Anwendung von biostatistischen Analysen wurde der Einfluss von messbaren Umweltfaktoren, wie etwa der Spurenstoffe, auf die mikrobiellen Gemeinschaften in den Sedimenten bewertet. Signifikante Veränderungen in der Alpha- und Beta-Diversität korrelierten dabei mit Sulfat (SO4 2-), das nicht durch das Klarwasser der Kläranlage in die Panke gelangte. Das Sulfat kann aus verschiedenen Quellen, wie etwa aus Sedimentablagerungen (z.B. Braunkohletagebaue und Pyritoxidation) oder der Landwirtschaft stammen. Somit zeigten die biostatistischen Analysen, dass keine weiteren Faktoren zur signifikanten Veränderung in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften führten. Ein kausaler Zusammenhang konnte zwischen dem Klarwasser und der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaften nicht beobachtet werden, und mit hoher Wahrscheinlichkeit spielen weitere Faktoren eine wichtige Rolle bei der Zusammensetzung der Biofilm-Gemeinschaften, die jedoch mit dem gewählten Studiendesign nicht erfasst werden. Diclofenac (DCF) konnte in Laborexperimenten mit Mangan-oxidierenden Bakterien (MOB) abgebaut werden, während ein Abbau von Carbamazepin und Gabapentin nicht nachgewiesen wurde. Signifikante DCF-Entfernungsraten wurden bei zwei Stämmen der a-Proteobakterien und einem g-Proteobakterium beobachtet, wobei Untersuchungen mit zwei Nährmedien durchgeführt wurden, die unterschiedliche Manganquellen (Mangancarbonat (MnCO3, 17 mM) oder Mangansulfat (MnSO4, 0,3 mM)), sowie variierende Kohlenstoffkonzentrationen (Hefeextrakt: 1 g L-1 oder 0,1 g L-1) aufwiesen. Dabei unterschieden sich die DCF-Entfernungsraten der MOB-Stämme Ideonella sp. A288 und Pseudomonas sp. OF001 dahingehend, dass ca. 19 μg L-1 DCF pro Tag durch Ideonella sp. A288 abgebaut wurden und pro Tag bis zu 200 μg L-1 durch Pseudomonas sp. OF001. Die beiden Stämme zeigten jedoch keine signifikanten Unterschiede bei den DCF-Abbauraten mit MnCO3 oder MnSO4 als Manganquelle in den Nährmedien. Unterschiede wurden bei den DCF-Abbauraten mit unterschiedlichen Manganquellen nur in Experimenten mit dem Bakterium Comamonadaceae A210 beobachtet. Dabei wurden höhere DCF-Abbauraten im LSM2-Medium (MnCO3; Hefeextrakt 1 g L-1) beobachtet. Des Weiteren wurde in Experimenten ohne aktive Zellen, die jedoch mit biologisch hergestellten Manganoxiden (BioMnOx) angereichert waren aufgezeigt, dass der DCF-Abbau nur durch aktive Zellen induziert wird. In Untersuchungen mit dem LC-MS-QToF wurden primäre DCFTransformationsprodukte (DCF-TP) mit Pseudomonas sp. OF001 nachgewiesen, wobei interessanterweise Unterschiede beim Abbauprozess im 803b Medium (MnSO4, niedriger Kohlenstoffgehalt) und dem LSM2-Medium (MnCO3, hoher Kohlenstoffgehalt) beobachtet wurden. 4'- Hydroxydiclofenac wurde als Primärmetabolit im 803b Medium nachgewiesen, während weitere Abbauexperimente eine Abnahme der aromatischen Ringstruktur in den UV-vis Spektren aufzeigten, die auf eine Öffnung der DCF-Ringstruktur schließen lassen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass mehrere MOB-Stämme DCF abbauen können, wobei sich die Abbauraten zwischen den MOBStämmen unterschieden und die Medienzusammensetzung ebenfalls eine entscheidende Rolle spielte. Durch die Genom-Information des Bakterienstamm Ideonella sp. A288 konnte das Vorliegen eines Multicopper-Oxidase-Gens identifiziert werden, das bei der Mn(II)-Oxidation aktiv beteiligt sein könnte. Um diese Hypothese zu bestätigen, müssten jedoch weitere Experimente durchgeführt werden.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/11566
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-10452
Exam Date: 10-Jul-2020
Issue Date: 2020
Date Available: 26-Aug-2020
DDC Class: DDC: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): micropollutants
microbial communities
16S rRNA gene amplicon sequencing
Manganese-oxidizing bacteria
biodegradation
Spurenstoffe
mikrobielle Gemeinschaften
16S rRNA-Gen Amplikon-Sequenzierung
Mangan-oxidierende Bakterien
biologischer Abbau
Sponsor/Funder: DFG, GRK 2032/1, Urban Water Interfaces (UWI)
License: http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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