Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-10529
For citation please use:
Main Title: Extracellular matrix- and pluripotent stem cell-based tissue engineering of the kidney
Translated Title: Tissue Engineering der Niere mittels extrazellulärer Matrix und pluripotenten Stammzellen
Author(s): Fischer, Iris
Advisor(s): Kurtz, Andreas
Stachelscheid, Harald
Reinke, Petra
Referee(s): Lauster, Roland
Kurtz, Andreas
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Complex, three-dimensional (3D) organ models are novel biotechnological tools for research on regeneration and disease mechanisms as well as drug development. An organ model of the kidney is urgently needed to break through decades of stagnation in the development of new treatment methods for patients with chronic kidney disease and to reduce the high failure rate of drugs in clinical tests due to nephrotoxic effects. The aim of this thesis was therefore the development of a human 3D kidney model. A functional kidney model should emulate the architecture and cell types of the kidney, as well as the mechanical properties and composition of the extracellular matrix. In order to emulate the function of the kidney, the model must be perfused. Therefore, a scaffold-based tissue engineering approach was chosen on the basis of decellularized whole rat kidneys, which should be recellularized with human renal precursor cells and endothelial cells differentiated from induced pluripotent stem cells. This approach required the development of a perfusion bioreactor and control software, which enabled the de- and recellularization of the kidneys as well as the subsequent in vitro cultivation. Decellularization is the process of removing all cells of an organ while preserving the extracellular matrix (ECM) in its native architecture and composition. The influence of different detergents and temperatures was analyzed, and the results showed that for the decellularization of tissue pieces immersion in the mild ionic detergent sodium deoxycholate (SDC) at 4 °C is optimal. However, decellularization of whole kidneys by perfusion required the strong ionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS). To improve the quality of the decellularized ECM it is beneficial to minimize the SDS concentration and application time as well as the temperature. All results were evaluated objectively and standardized by applying a point-based scoring system, which was also developed in the course of the thesis. Next, an efficient recellularization strategy had to be identified. The tested strategies included cell seeding through the renal artery with or without high pressure, seeding through the ureter with or without vacuum and direct injection into the parenchyma with a syringe. The vascular tree of the decellularized kidney was successfully recellularized with endothelial cells seeded via the renal artery. However, recellularization of the parenchyma with renal progenitor cells resulted in low seeding efficiencies in all applied seeding approaches. A maximum of 1% of the parenchyma could be repopulated by recellularization. In addition, the recellularization caused damage to the scaffold architecture and the arrangement of the cells did not correspond to the physiological renal structures. In parallel, the influence of mechanical and biochemical properties of the ECM on the maturation of renal progenitor cells was investigated. The cells were cultivated on surfaces of different stiffnesses and ECM coatings. With increasing stiffness, the renal progenitor cells increasingly matured into renal tubular epithelial cells, whereas podocyte maturation behaved inversely. In addition, the analysis revealed that the ECM protein laminin, in contrast to collagen IV, promotes the maturation of renal progenitor cells into renal tubular epithelial cells, although no difference was detected between the laminin isoforms 511 and 521. Although no kidney model could be generated with the investigated methods, the technical developments and the findings of this thesis mark a further step on the way to a human 3D kidney model.
Komplexe, dreidimensionale (3D) Organmodelle sind neuartige biotechnologische Werkzeuge für die Erforschung von Regenerations- und Krankheitsmechanismen sowie für die Medikamentenentwicklung. Ein solches Modell der Niere könnte die jahrzehntelange Stagnation in der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden für Patienten mit chronischem Nierenversagen durchbrechen, sowie die hohe Durchfallrate neuer Medikamente in klinischen Tests durch nephrotoxische Effekte reduzieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Entwicklung eines humanen 3D Nierenmodelles. Ein funktionsfähiges Nierenmodell sollte die Architektur und die Zelltypen der Niere, sowie die mechanischen Eigenschaften und die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix nachahmen und zudem perfundiert sein. Daher wurde ein Scaffold-basierter Ansatz der Gewebezüchtung auf der Basis von dezellularisierten ganzen Rattennieren gewählt, die mit humanen Nierenvorläuferzellen und Endothelzellen, differenziert aus induzierten pluripotenten Stammzellen, rezellularisiert werden sollten. Dieser Ansatz machte die Entwicklung eines Perfusionsbioreaktors und einer Steuerungssoftware nötig, die die De- und Rezellularisierung der Nieren sowie die darauffolgende In-vitro-Kultivierung erst ermöglichten. Dezellularisierung ist die Entfernung aller Zellen eines Organs, bei der die extrazelluläre Matrix (EZM) in ihrer nativen Architektur und Zusammensetzung erhalten bleibt. In dieser Arbeit wurde durch den Vergleich des Einflusses verschiedener Detergenzien sowie Temperaturen gezeigt, dass für die Dezellularisierung von Nierengewebsstücken das Untertauchen in dem milden ionischen Detergens Natriumdesoxycholat (SDC) bei 4 °C optimal ist. Für die Dezellularisierung ganzer Nieren durch Perfusion ist jedoch das starke ionische Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) nötig. Sowohl die Minimierung der SDS-Konzentration und -Anwendungsdauer als auch der Temperatur während der Dezellularisierung verbessern dabei die Qualität der dezellularisierten EZM. Alle Ergebnisse wurden mittels eines punktebasierten Bewertungssystems, welches ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit entwickelt wurde, objektiv und standardisiert beurteilt. Um eine effiziente Rezellularisierungsstrategie zu identifizierten wurden Zellen mit oder ohne Hochdruck durch die Nierenarterie, mit oder ohne Vakuum durch den Ureter oder durch eine direkte Injektion in die dezellularisierten Nieren eingesät. Der Gefäßbaum konnte erfolgreich mit Endothelzellen, die durch die Nierenarterie eingesät wurden, rezellularisiert werden. Die Rezellularisierung des Parenchyms mit Nierenvorläuferzellen resultierte jedoch mit allen getesteten Rezellularisierungsstrategien in geringen Wiederbesiedlungseffizienzen. So konnten maximal 1% des Parenchyms wiederbesiedelt werden, zudem entstanden Schäden in der Architektur und die Anordnung der Zellen entsprach nicht den physiologischen renalen Strukturen. Parallel dazu wurde der Einfluss der mechanischen und biochemischen Eigenschaften der EZM auf die Ausreifung der Nierenvorläuferzellen untersucht. Dazu wurden diese auf Oberflächen verschiedener Steifigkeiten und EZM-Beschichtungen kultiviert. Mit steigender Steifigkeit reifen die Nierenvorläuferzellen zunehmend in renale Tubulusepithelzellen aus, wohingegen sich die Podozytenausreifung invers verhält. Zudem wurde nachgewiesen, dass das EZM-Protein Laminin, im Gegensatz zu Collagen IV, die Ausreifung der Nierenvorläuferzellen in renale Tubulusepithelzellen fördert, wobei zwischen den Laminin-Isoformen 511 und 521 kein Unterschied besteht. Auch wenn mit den gewählten Methoden kein Nierenmodell generiert werden konnte, so markieren doch die technischen Entwicklungen und die Erkenntnisse, die in dieser Arbeit gewonnen worden, einen weiteren Schritt in Richtung eines humanen 3D Nierenmodells.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/11641
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-10529
Exam Date: 27-Nov-2019
Issue Date: 2020
Date Available: 24-Sep-2020
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): kidney
pluripotent stem cells
tissue engineering
perfusion bioreactor
extracellular matrix
Niere
pluripotente Stammzellen
Gewebszüchtung
Perfusionsbioreaktor
extrazelluläre Matrix
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Appears in Collections:FG Medizinische Biotechnologie » Publications

Files in This Item:
fischer_iris.pdf
Format: Adobe PDF | Size: 14.51 MB
DownloadShow Preview
Thumbnail

Item Export Bar

This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons