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Main Title: Biochemical characterization of the organohalide respiration complex in Dehalococcoides mccartyi strain CBDB1
Translated Title: Biochemische Charakterisierung des Organohalid-Atmungskomplexes in Dehalococcoides mccartyi Stamm CBDB1
Author(s): Seidel, Katja
Advisor(s): Adrian, Lorenz
Referee(s): Neubauer, Peter
Adrian, Lorenz
Pereira, Inês
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Halogenated organic compounds of anthropogenic origin are often classified as environmental pollutants due to their strong persistence. However, microbial degradation or transformation has been described for many of the anthropogenic organohalides and biotechnological processes have been developed to use the responsible organisms for bioremediation at contaminated field sites. Bacteria of the class Dehalococcoidia are known to biodegrade many different halogenated organic compounds and they are already used for bioremediation. These bacteria are able to breath with halogenated organic compounds by using them as terminal electron acceptor. Respiration with organohalogens is termed organohalide respiration and the key enzyme in this process is a membrane-bound reductive dehalogenase (RdhA). Investigation of the pure culture Dehalococcoides mccartyi strain CBDB1 recently described the reductive dehalogenase as subunit of a higher molecular weight complex, termed ‘organohalide respiration’ (OHR) complex. This study focused on the study of subunit composition of the OHR complex, the mass spectrometric detection of integral membrane proteins, especially the small integral membrane protein RdhB, predicted to anchor the reductive dehalogenase (RdhA) in the membrane, and attempts to shield light into the stoichiometry of participating subunits. Furthermore protein-protein interactions within the complex were quantitatively analysed to obtain information about the topology and interaction strengths. Structural predictions in combination with experimental data were used to obtain insights into structure-function relationship. For improvement in detection of integral membrane proteins several strategies mainly involving solubilisation, membrane shaving, small protein resolving gels followed by mass spectrometric analysis and top-down mass spectrometry were applied. The most promising techniques were membrane shaving and small protein resolving gels in combination with solubilisation. With these methods several peptides of ten different RdhB proteins could be identified covering between 6.4 % and 33 % of RdhB sequence with good reliability. The other integral membrane protein OmeB of the OHR complex was also identified with 23 peptides covering 41.2 % of its sequence. The confirmation of OHR complex subunits and their interactions was analysed using the method of complexome analysis. This method combined separation of solubilized proteins on a native gel and mass spectrometric analysis of the entire gel lane that was cut into many small slices. Using different solubilisation strength by different extraction modes not only confirmed the subunits of the OHR complex but also revealed interactions of the subunits. Of special interest was an organization into three larger modules using intermediate solubilisation strength of the hydrogenase subunits HupL and HupS, the Ome module consisting of OmeA, OmeB and HupX as well as an Rdh module of RdhA and RdhB. Furthermore the interaction between RdhA and RdhB could be shown for the first time with this approach. Interactions of the modules led to the proposal of a triangular topology of the complex. Additional potential interaction partners, a hypothetical periplasmic protein and an HppA protein, were identified. More information about protein structures of the subunits was obtained using protein chemical cross-linking data in combination with structural prediction of the subunits. Solubilisation and a cross-linking reaction including an enrichment step revealed higher numbers of cross-linked products for OHR complex subunits compared to cross-linking alone. Intra-molecular cross-links were found for RdhA CbdbA84 and OmeA and were in agreement with structure predictions of those two proteins. Additionally, solvent-accessible sites were calculated from predicted protein structures and compared with modifications obtained by the applied cross-linker. This resulted in expected modifications for solvent-accessible sites and also modifications within RdhA proteins that were not predicted to be solvent-accessible but modified. Such modified residues might represent amino acids participating in formation of the substrate channel. Furthermore the structure of the Ome module was compared to known structures of other membrane protein complexes to confer for a potential way of proton translocation needed to generate a proton motif force for ATP generation.
Halogenierte organische Stoffe, die von Menschen hergestellt wurden, werden häufig auf Grund ihrer hohen Persistenz als Umwelt-Schadstoffe eingeordnet. Jedoch gibt es Mikroorganismen, die viele solcher menschengemachten Organohalide abbauen oder umwandeln können, wodurch biotechnologische Prozesse entwickelt werden konnten, um eben die dafür verantwortlichen Organismen zur Bioremediation von kontaminierten Standorten einzusetzen. Bakterien der Klasse Dehalococcoidia sind bekannt dafür, verschiedene halogenierte organische Verbindungen abzubauen und werden bereits zur Bioremediation eingesetzt. Diese Bakterien besitzen die Fähigkeit halogenierte organische Verbindungen zu veratmen, indem sie diese als terminale Elektronenakzeptoren nutzen. Atmung mit Organohaliden wird auch als Organohalid-Respiration bezeichnet und das Schlüsselenzym dieses Prozesses ist eine membrangebundene reduktive Dehalogenase (RdhA). Untersuchungen des Reinstammes Dehalococcoides mccartyi Stamm CBDB1 ergaben, dass reduktive Dehalogenasen Untereinheiten in einem Komplex mit höherem Molekulargewicht sind, dem sogenannten ‚Organohalid-Respiration‘ (OHR) Komplex. Der Fokus in dieser Studie liegt auf der Zusammensetzung der Untereinheiten des OHR Komplexes, der massenspektrometrischen Detektion integraler Membranproteine, vor allem des integralen Membranproteins RdhB, das vermutlich die reduktive Dehalogenase in der Membran verankert, sowie der Stöchiometrie der beteiligten Untereinheiten. Weiterhin wurden Protein-Protein-Interaktionen innerhalb des Komplexes quantitativ untersucht, um Aufschluss über die Struktur des Komplexes und die Stärke der Interaktionen zu erhalten. Strukturvorhersagen in Kombination mit experimentellen Daten wurden genutzt, um Einblicke in den Zusammenhang von Struktur und Funktion zu erhalten. Für die verbesserte Detektion integraler Membranproteine wurden verschiedene Strategien angewendet, wie der Solubilisierung, des ‚Membrane Shaving‘, sowie Gele zur Auftrennung kleiner Proteine, gefolgt von einer massenspektrometrischen Analyse , aber auch wurde ein massenspektrometrischer Top-down-Ansatz getestet. Die vielversprechendsten Ansätze waren dabei das ‚Membrane Shaving’ und die Gele zur Auftrennung kleiner Proteine kombiniert mit Solubilisierung. Mit diesen beiden Methoden konnten unterschiedliche Peptide von zehn verschiedenen RdhB Proteinen mit einer hohen Verlässlichkeit identifiziert werden, welche 6,4 % bis 33 % der RdhB Sequenzen abdeckten. OmeB, als zweite integrale Membranuntereinheit des OHR Komplexes konnte ebenfalls mit 23 Peptiden und einer Sequenzabdeckung von 41,2 % identifiziert werden. Zur Bestätigung der beteiligten Untereinheiten im OHR Komplex und deren Interaktionen kam eine Methode, die als Komplexomanalyse bezeichnet wird, zum Einsatz. Bei dieser Methode wird die Auftrennung solubilisierter Proteine in einem nativen Gel kombiniert mit der massenspektrometrischen Analyse der gesamten Gelspur, welche in viele kleine Teile geschnitten wurde. Verschiedene Solubilisierungs-Stärken durch unterschiedliche Protein-Extraktionsmethoden bestätigten nicht nur beteiligten Untereinheiten des OHR Komplexes,sondern zeigten auch Interaktionen zwischen den Untereinheiten auf. Von speziellem Interesse ist hierbei die Organisation in drei größere Module durch eine Methode mit mittlerer Stärke für die Solubilisierung. Diese Module bestehen aus dem Hydrogenase Modul - HupL und HupS, dem Ome Modul aus OmeA, OmeB und HupX, sowie dem Rdh Modul aus RdhA und RdhB. Des Weiteren konnte mit dieser Methode zum ersten Mal die Interaktion zwischen RdhA und RdhB gezeigt werden. Interaktionen zwischen den Modulen lassen auf eine mögliche trianguläre Topologie des Komplexes schließen. Darüber hinaus wurden weitere mögliche Interaktionspartner identifiziert, ein hypothetisches periplasmatisches Protein und ein HppA Protein. Weitere Informationen zur Proteinstruktur der Untereinheiten wurden durch den Einsatz von chemischem ‚Cross-Linking‘ zusammen mit Strukturvorhersagen erhalten. Die Verbindung von Solubiliserung und ‚Cross-Linking‘-Reaktionen die einen Anreicherungsschritt enthielten, ergaben eine höhere Anzahl an ‚Cross-Linking‘-Produkten für Untereinheiten des OHR Komplexes, als ein Ansatz in dem ausschließlich ‚Cross-Linking‘ durchgeführt wurde. Intramolekulare Quervernetzungen wurden für das RdhA Protein CbdbA84 und OmeB gefunden und stimmen mit den Strukturvorhersagen für diese beiden Proteine überein. Weiterhin wurde aus den Protein-Strukturvorhersagen berechnet, welche Aminosäurereste lösungsmittelzugänglich sind und diese Informationen wurden mit den Modifikationen, die durch Anwendung der ‚Cross-Linker‘ erhalten wurden, verglichen. Dies ergab erwartete Modifikationen an lösungsmittelzugänglichen Resten, aber es konnten auch Modifikationen innerhalb der RdhA Proteine gefunden werden, die nicht als lösungsmittelzugänglich vorhergesagt wurden. Solche modifizierten Aminosäurereste könnten Aminosäuren sein, an der Bildung des Substratkanals beteiligt sind. Des Weiteren wurde die Ome Modulstruktur mit bereits bekannten Strukturen andere Membranproteinkomplexe verglichen, um mögliche Wege der Protonentranslokation, die für die Bildung einer protonenmotorischen Kraft zur ATP Herstellung notwendig sind, zu identifizieren.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/11677
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-10565
Exam Date: 16-Jul-2020
Issue Date: 2020
Date Available: 9-Oct-2020
DDC Class: 572 Biochemie
Subject(s): organohalide respiration
Dehalococcoides
respiratory complex
complexome analysis
mass spectrometry
protein chemical cross-linking
Organohalidatmung
Atmungskomplex
Komplexomanalyse
Massenspektrometrie
Sponsor/Funder: DFG, 171475307, Biochemie der Atmungskette in Dehalococcoides Stamm CBDB1
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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