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Main Title: Biochemical and spectroscopic insights into peculiar active site structures and biosynthesis of O2-tolerant [NiFe]-hydrogenases
Translated Title: Biochemische und spektroskopische Einblicke in besondere Strukturen des aktiven Zentrums und Biosynthese von O2-tolerant [NiFe]-Hydrogenasen
Author(s): Schulz, Anne-Christine
Advisor(s): Lenz, Oliver
Referee(s): Hildebrandt, Peter
Sawers, Gary
Lenz, Oliver
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: [NiFe]-hydrogenases are metalloenzymes catalyzing the reversible cleavage of H2 into two H+ and two e–. They are particularly interesting for clean and sustainable H2-based energy conversion approaches or the H2-driven regeneration of nucleotide cofactors. Their active site consists of a NiFe(CN)2(CO) moiety coordinated to the protein by four strictly conserved cysteine residues. Two of them serve as terminal ligands to the Ni and two are bridging ligands coordinating both, the Ni and Fe. The Fe is additionally equipped with one carbon monoxide (CO) and two cyanide (CN–) ligands. The maturation of the NiFe(CN)2(CO) active site involves at least six auxiliary proteins, namely HypA-F. A seventh Hyp protein, HypX, is required for aerobic CO ligand biosynthesis. Although, the biosynthesis of [NiFe]-hydrogenases has been studied extensively, many details of their maturation still remain elusive. Because of its O2-tolerance and thermostability, the soluble, NAD+-reducing [NiFe]- hydrogenases from Hydrogenophilus thermoluteolus (HtSH) is of special biotechnological interest. Previous studies unveiled unusual structural and spectroscopic properties of the oxidized enzyme. Here, we present evidence by protein biochemistry in combination with infrared spectroscopy that the peculiar active site structure is causative for the unusual spectroscopic properties and probably related to a novel O2 protection mechanism. The second part of this thesis focused on the maturation of [NiFe]-hydrogenases, especially the assembly of the Fe(CN)2(CO) moiety. Therefore, purified HypCD was biochemically and spectroscopically investigated and apo-HypCD was used in in vitro maturation experiments. The preliminary results presented here, help to address open questions regarding the Fe(CN)2(CO) moiety assembly process, the order of ligand attachment as well as the coordination and characterization of the Fe(CN)2(CO) moiety and its transfer to the hydrogenase apo-large subunit. Furthermore, a comprehensive biochemical characterization of HypX revealed detailed insight into the mechanism of aerobic CO ligand synthesis. In the proposed mechanism, the formyl group of N10-formyl-THF is first transferred to Coenzyme A (CoA) producing formyl-CoA, which, in the second step, becomes decarbonylated to form CoA and CO.
[NiFe]-Hydrogenasen sind Metalloenzyme, welche die reversible Umwandlung von H2 in zwei H+ und zwei e– katalysieren. Dies macht sie besonders interessant für saubere und nachhaltige H2-basierte Energieumwandlungsansätze oder die H2-getriebene Regeneration von NukleotidCofaktoren. Ihr aktives Zentrum besteht aus einem NiFe(CN)2(CO) Cofaktor, der über vier strikt konservierte Cysteinreste an das Protein koordiniert ist. Zwei von ihnen dienen als terminale Liganden des Ni und die anderen beiden sind verbrückende Liganden, die sowohl das Ni als auch das Fe koordinieren. Das Fe ist zusätzlich mit einem Kohlenstoffmonoxid- (CO) und zwei Cyanid-Liganden ausgestattet. An der Reifung des NiFe(CN)2(CO) Zentrums sind mindestens sechs Hilfsproteine beteiligt, die Proteine HypA-F. Ein siebtes Hyp-Protein, HypX, wird für die aerobe Synthese des CO Liganden benötigt. Obwohl die Reifung der [NiFe]- Hydrogenasen intensiv untersucht wird, sind viele Details noch nicht bekannt. Aufgrund ihrer O2-Toleranz und ihrer Thermostabilität ist die lösliche, NAD+-reduzierende [NiFe]-Hydrogenase aus Hydrogenophilus thermoluteolus (HtSH) von besonderem biotechnologischen Interesse. Frühere Studien zeigten ungewöhnliche strukturelle und spektroskopische Eigenschaften des oxidierten Enzyms. Hier präsentieren wir Beweise dafür, dass sowohl die ungewöhnliche Struktur des aktiven Zentrums als auch das beispiellose spektroskopische Merkmal demselben Zustand entsprechen, der einen neuartigen O2- Schutzmechanismus darstellen könnte. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit der Reifung der [NiFe]-Hydrogenasen, insbesondere mit der Assemblierung der Fe(CN)2(CO) Einheit. Hierfür wurde gereinigtes HypCD biochemisch und spektroskopisch untersucht und apo-HypCD wurde für in vitro Maturationsversuche verwendet. Die hier gezeigten vorläufigen Ergebnisse helfen bei der Beantwortung offener Fragen bezüglich des Mechanismus und der Reihenfolge der Ligandenbindung, der Koordination und Charakterisierung des Vorläufer-Fe und der Fe(CN)2(CO) Einheit und dessen Transfer in die große Untereinheit der Hydrogenase. Darüber hinaus ergab eine umfassende biochemische Charakterisierung von HypX detaillierte Einblicke in den Mechanismus der aeroben CO-Ligandensynthese. Bei dem vorgeschlagenen Mechanismus wird die Formylgruppe von N10-Formyl-THF zuerst auf Coenzym A (CoA) übertragen, wodurch Formyl-CoA erzeugt wird, das in einem zweiten Schritt unter Bildung von CoA und CO decarbonyliert wird.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/12085
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-10960
Exam Date: 23-Nov-2020
Issue Date: 2021
Date Available: 26-Jan-2021
DDC Class: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Subject(s): metalloenzyme
hydrogenase
nickel
maturation
carbon monoxide
Metalloenzym
Hydrogenase
Nickel
Maturation
Kohlenstoffmonoxid
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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