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Main Title: Identification of protein-protein-interactions in vitro based on high-density protein arrays
Translated Title: Identifizierung von Protein-Protein-Interaktionen in vitro auf Grundlage von Hochdichte-Protein-Arrays
Author(s): Faupel, Thomas
Advisor(s): Buessow, Konrad
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: In dieser Arbeit wurde eine in vitro-Strategie zur Identifizierung und Verifizierung von Protein-Protein-Interaktionen auf Grundlage von Hochdichte-Protein-Arrays entwickelt. Humane Proteine, die eine zentrale Rolle bei der Ausprägung neurodegenerativer Krankheiten spielen, wurden in E.coli entweder als GST-Fusionsprotein oder mit einem Hexahistidin-tag exprimiert und konnten mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Mit radioaktiv markierten GST-Fusionsproteinen als Sonden wurden 96 Proteine mit Hexahistidin-tag, die auf einer Polyvinyldifluorid-Membran als Array immobilisiert waren, auf Protein-Protein-Interaktionen untersucht. In einem ersten Experiment wurden zunächst die SH3-Domäne von Endophilin-1 (SH3E1) und ein C-terminales Fragment des Hitzeschock-Proteins Hsc70 als Sonden eingesetzt. Interaktionen zwischen Hsc70 und dem Hitzeschock-Protein HOP, sowie SH3E1 mit einem Fragment von Amphiphysin-1 konnten so bestätigt werden. Die entwickelte Methode wurde auf einen Hochdichte-Protein Array angewandt, um neue Interaktionspartner der SH3-Domäne von Endophilin-1 zu identifizieren. Der aus einer humanen cDNA-Expressionsbank generierte Hochdichte-Protein-Array besteht aus 36,864 Klonen, die in einem geordneten Muster als Dublets auf zwei Polyvinyldifluorid-Membranen gespottet wurden. Das Spotting wurde am Deutschen Ressourcenzentrum RZPD durchgeführt. Im Screen mit SH3E1 wurden 30 Klone aus der cDNA-Expressionsbank identifiziert, die ein Protein oder Proteinfragment im Leserahmen mit dem Vektor-kodierten Hexahistidin-tag exprimierten. Ein bereits bekannter Interaktionspartner von Endophilin-1, (ALG-2)-interacting protein 1 (Alix), wurde in diesem Screen bestätigt. Die neu gefundenen Interaktionspartner wurden über ihren Hexahistidin-tag affinitätschromatographisch aufgereingt und anschliessend in Pulldown-Assays eingesetzt, um eine Bindung mit SH3E1 als GST-Fusionsprotein zu bestätigen. Mögliche Binderegionen der SH3-Domäne innerhalb der Primärsequenz der im Pulldown verifizierten Interaktionspartner wurden mittels eines Peptid-Scans lokalisiert. Durch den Einsatz von Hochdichte-Protein-Arrays in Kombination mit Pulldown-Assays und Peptid-Scans konnten Interaktionen von SH3E1 mit Alix, disks large-associated protein 4 (DAP4), cysteine/glycine-rich protein 2 (CRP2), capicua homolog (CIC), heterogenous nuclear ribonucleoprotein A1 (HNRPA1), microtubule-associated protein 1A light chain 3A (MAP1ALC3), SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 1 (SRGAP1), Gli-Krüppel family member (GLI3) sowie den hypothetischen Proteinen FLJ10101, C18ORF11 und KIAA1295 identifiziert und bestätigt werden. Für die Proteine Alix, DAP4, CIC, MAP1LC3A, SRGAP1, FLJ10101, C18ORF11, KIAA1295 und NGFI-A binding protein 2 (NAB2) konnten SH3-Bindemotive nachgewiesen werden.
An in vitro screening method was developed which allows to identify and verify protein-protein-interactions based on high-density protein arrays. Human proteins which play a central role in neurodegenerative disorders were expressed in E.coli as fusions with GST or with a hexahistidine-tag. The fusion portion allowed affinity purification of the recombinant proteins. In a proof-of-principle approach 96 hexahistidine-tagged proteins were immobilized on a polyvinyldifluoride membrane and were assayed for their interaction with radiolabeled GST fusion protein of the C-terminus of 70 kDa heat shock cognate protein (Hsc70) and the SH3 domain of endophilin-1 (SH3E1). Interaction of Hsc70 with the heat shock organizing protein HOP as well as SH3E1 with a fragment of amphiphysin-1 was verified by this approach. To discover novel interaction partners for SH3E1, the developed screening method was applied to a high-density protein array generated from a human fetal brain cDNA expression library. The high-density protein array consisted of 36,864 individual clones spotted in duplicates by a robot on two polyvinyldifluoride membranes. Robotic spotting was performed at the German Resource Center RZPD. The screening approach identified 30 clones from the cDNA library which expressed a protein in frame with the vector-encoded hexahistidine-tag and were specific for SH3E1. One clone expressed a C-terminal fragment of (ALG-2)-interacting protein 1 (Alix), a previously reported interaction partner of endophilin-1. His-tagged proteins were affinity purified and used in pulldown assays to confirm the binding of SH3E1 to the discovered interaction partners in vitro. Possible binding regions of SH3E1 were mapped, using scans of peptides delineated from the identified interaction partners. Combination of the high-density protein array screen with independent pulldown assays and peptide scans confirmed the interaction of SH3E1 with Alix, disks large-associated protein 4 (DAP4), cysteine and glycine-rich protein 2 (CRP2), capicua homolog (CIC), heterogenous nuclear ribonucleoprotein A1 (HNRPA1), microtubule-associated protein 1A light chain 3A (MAP1ALC3), SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 1 (SRGAP1), Gli-Krüppel family member (GLI3) and the hypothetical proteins FLJ10101, C18ORF11 and KIAA1295. Peptide scans mapped possible binding regions for Alix, DAP4, CIC, MAP1LC3A, SRGAP1, FLJ10101, C18ORF11, KIAA1295 and NGFI-A binding protein 2 (NAB2).
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-8156
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1212
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-915
Exam Date: 23-Sep-2004
Issue Date: 4-Nov-2004
Date Available: 4-Nov-2004
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): CDNA-Expressionsbank
Endophilin-1
Hochdichte-Protein-Array
Peptid-Scan
Protein-Protein-Interaktion
Pulldown-Assay
Screening
SH3-Domäne
CDNA expression library
Endophilin-1
High-density protein array
Peptide scan
Protein-protein-interaction
Pulldown assay
Screening
SH3 domain
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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