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Main Title: CD40 stimulation activates ‘post-activated’ B Cells which are hyporesponsive to B Cell receptor and toll-like receptor 9 stimulation in autoimmunity
Translated Title: CD40-Stimulation aktiviert ‘post-aktivierte’ B-Zellen, welche hyporesponsiv gegenüber B-Zellrezeptor- und Toll-like-Rezeptor-9-Stimulation in Autoimmunerkrankungen sind
Author(s): Weißenberg, Sarah Yasmin
Advisor(s): Dörner, Thomas
Referee(s): Lauster, Roland
Dörner, Thomas
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: Autoimmunity arise when the immune system attacks self-antigens and destroys body’s own cells and tissues. Chronic autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA) and the primary Sjögren’s syndrome (pSS) decrease life quality of patients and can lead to life threatening events such as lupus nephritis [1]. Recognition of self-antigens by the B cell receptor (BCR), development of autoimmune memory and beneficial therapeutic approaches by targeting B cells highlight the pathogenic role of B cells in development and maintenance of autoimmunity [2-10]. Genotyping and genome wide association studies (GWAS) of B cells from autoimmune patients and functional studies in human and mice underline the role of altered BCR signaling and its contribution to autoimmunity [11-16]. Strength of the BCR signal together with co-signals such as cytokines, toll-like receptor (TLR) signaling and interaction with T cells determines cell fate [17-21]. However, the literature is conflicting on whether BCR signaling is reduced or increased [14-16]. Recently, our group reported unbalanced BCR signaling with significantly reduced phosphorylation of the protein tyrosine kinase (PTK) spleen tyrosine kinase (Syk) and reduced intracellular Ca2+ release in SLE B cells [14]. Further studies reported reduced responsiveness of SLE B cells to TLR9 stimulation which recognizes nuclear antigens and is considered key in self-tolerance brake to nuclear antigens together with the BCR [22-25]. T cell help by CD40-CD40L binding drives germinal center (GC) reaction and the development of long term (auto)-immune B cell memory and is further known to augment BCR signaling via Syk [26, 27]. To draw a more general picture of B cell activation in autoimmunity, this study aimed at comparatively analyzing the nature of peripheral B cell activation in different autoimmune diseases, mainly SLE, RA and pSS, with emphasis on BCR, TLR9 and CD40 signaling. To do so, BCR signaling quality was assessed in peripheral and tissue resident CD27- B cells and CD27+ memory B cells by ex vivo analysis of tonic and anti-IgG/IgM induced tyrosine (Y or Tyr) or serine (S or Ser) phosphorylation of the kinases Syk, Bruton’s tyrosine kinase (Btk) and protein kinase B (Akt). This was supplemented by data on protein tyrosine phosphatase (PTP) and protein serine/threonine phosphatase (PSP) activities and recruitment of the PTP Src homology region 2 (SH2) domain-containing phosphatase-1 (SHP-1). The relevance of cytokines, epigenetic methylation and chronic stimulation of TLR9 and the BCR was assessed. The potential of TLR9 and TLR9 together with BCR activation to induce proliferation and differentiation into antibody secreting cells (ASCs) was comparatively analyzed and finally, the impact of CD40/CD40L with and without interleukin (IL)-4 or IL-21 interaction on BCR-induced Syk(Y352) phosphorylation and in vitro proliferation and differentiation of B cells was determined. This was completed by expression data of selected PTPs and PSPs upon CD40/IL-4 co-stimulation. As a commonality, phosphorylation of the PTKs Syk(Y352) and Btk(Y223) was reduced in peripheral CD27+ memory B cells from SLE, RA and pSS patients in comparison to healthy donor (HD) controls. Notably, Syk(Y352) phosphorylation was diminished in peripheral SLE CD27- B cells compared to HD controls and in tissue resident CD27+ B cells from patients with immune thrombocytopenia (ITP) and pSS compared to non-autoimmune patients, too. However, Akt(S473) phosphorylation kinetics were increased in SLE CD27- and CD27+ B cells and comparable to HDs in pSS and RA B cells. PTP/PSP activities in SLE and overall baseline recruitment of SHP-1 to the negative co-receptor CD22 in SLE, RA and pSS peripheral CD19+ B cells were increased compared to HDs. Signaling abnormalities of SLE, RA and pSS B cells did not correlate to differences in tonic phosphorylation or baseline expression of signaling molecules (Syk, Btk, 1 Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2 (PLCγ2) and Akt), cytokine expression/stimulation and epigenetic programming. However, chronic in vitro stimulation of the BCR led to reduced Syk(Y352) phosphorylation upon re-stimulation after 24 h, 48 h and 72 h. Proliferation and differentiation into CD27+CD38+ ASCs of SLE, RA and pSS peripheral CD19+ B cells was reduced upon in vitro TLR9 stimulation compared to HD controls. Combined BCR and TLR9 activation enhanced proliferation and differentiation of SLE, RA and pSS CD19+ B cells only to a certain degree. CD40 in vitro co-stimulation with and without IL-4 or IL-21 increased anti-IgG/IgM induced Syk(Y352) phosphorylation in SLE, RA, pSS and HD peripheral B cells. Interestingly, SLE CD27- B cells increased their Syk(Y352) phosphorylation to HD values. Furthermore, CD40 co-stimulation led to high proliferation of SLE, RA, pSS and HD CD19+ B cells. Improvements of CD40 co-stimulation correspond to reduced gene expression of non-receptor-type PTPs (NRPTPs) such as tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 2 (PTPN2) and PTPN22, and several receptor-type PTPs (RPTPs) in HD as well as SLE CD19+ B cells upon CD40L/IL-4 co-stimulation. Contrary to the general understanding of B cell hyperreactivity in autoimmune diseases, this study found peripheral and tissue resident B cell from autoimmune patients being functionally impaired towards BCR and TLR9 stimulation due to increased negative regulation by PTPs such as SHP-1. However, the strongest phenotype was observed in SLE B cells. This reduced responsiveness may be functionally related to B cell anergy and likely reflects a ‘post-activation’ status due to chronic B cell activation rather than a general signaling abnormality. The results underline that communication of B and T cells via CD40/CD40L interaction might be key for activating ‘post-activated’ B cells in autoimmune diseases via downmodulation of PTPs. Therefore, new therapeutic approaches may target B cell activation via CD40 or negative regulation of PTPs via the BCR.
Autoimmunität entsteht, wenn das Immunsystem körpereigene Strukturen (Autoantigene) erkennt. Dies führt zur Zerstörung von Zellen und Geweben. Chronische Autoimmunerkrankungen wie z. B. der Systemischer Lupus Erythematosus (SLE), Rheumatoide Arthritis (RA) und das primäre Sjögren Syndrom (pSS), schränken zum einen die Lebensqualität der Patienten stark ein und zum anderen können sie lebensbedrohliche Krankheitsverläufe wie z. B. eine Lupus-Nephritis entwickeln [1]. Die Erkennung von Autoantigenen mittels des B-Zellrezeptors (B cell receptor, BCR), die Bildung eines Autoimmungedächtnisses und die Wirksamkeit von B-Zell-gerichteten Therapiestrategien unterstreichen die pathogene Rolle von B-Zellen bei der Entstehung und Progression von Autoimmunerkrankungen [2-10]. Durch Genotypisierungs- und genomweite Assoziationsstudien (GWAS) von B-Zellen aus Autoimmunpatienten, sowie durch funktionelle Untersuchungen von B-Zellen in Menschen und Mäusen, konnten Zusammenhänge von veränderten BCR-Signalen und Autoimmunität aufgezeigt werden [11-16]. Die Stärke des BCR-Signals zusammen mit Co-Signalen, wie z. B. Toll-like Rezeptor (TLR)-Signalen und Interaktionen mit T-Zellen, sind entscheidend für die Entwicklung von B-Zellen [17-21]. Bezüglich der Qualität des BCR-Signals in Autoimmunerkrankungen, ob erhöht oder erniedrigt, gibt es unterschiedliche Hinweise in der Literatur [14-16]. Kürzlich berichtete unserer Gruppe von einer BCR-Dysbalance in B-Zellen von SLE Patienten, welche sich durch reduzierte Phosphorylierung der Protein Tyrosinkinase (PTK) spleen tyrosine kinase (Syk) und folglich reduzierter Freisetzung von intrazellulärem Ca2+ auszeichnet [14]. Des Weiteren gibt es Berichte über eine reduzierte Reaktivität von SLE B-Zellen gegenüber TLR9-Signalen. Der TLR9 ist für die Erkennung von nukleären Antigenen verantwortlich und bildet vermutlich zusammen mit dem BCR ein Schlüsselsignal für den Bruch der Selbsttoleranz gegenüber nukleären Antigenen [22-25]. T-Zellhilfe via CD40/CD40-Ligand (CD40L) Interaktion ist ein entscheidendes Signal für die Keimzellreaktion (germinal center (GC) reaction). Dadurch wird die Entwicklung eines langzeitigen B-Zell-(Auto-)Immungedächtnisses initiiert und verstärkt das BCR-Signal via Syk [26, 27]. Ziel dieser Studie war es, ein übergeordnetes Bild über die molekularen Prozesse während der B-Zellaktivierung in der Autoimmunität zu erhalten. Zu diesem Zweck wurde eine vergleichende Analyse von peripheren B-Zellen aus verschiedenen Autoimmunerkrankungen, insbesondere SLE, RA und pSS, mit besonderem Schwerpunkt auf die BCR, TLR9 und CD40-Aktivierung durchgeführt. Ex vivo Analysen der tonischen und anti-IgG/IgM-induzierten Tyrosin- (Y oder Tyr) oder Serin- (S oder Ser) Phosphorylierung der Kinasen Syk, Bruton’s tyrosine kinase (Btk) und Protein Kinase B (Akt) in konventionellen CD27- B-Zellen und CD27+ B-Gedächtniszellen lieferten eine Aussage über die Qualität des BCR-Signals. Ergänzt wurden diese Untersuchungen mit Daten zur Protein-Tyrosin-Phosphatase (PTP) und Protein-Serin/Threonin-Phosphatase- (PSP) Aktivität, sowie der Rekrutierung von PTP Src homology region 2 (SH2) domain-containing phosphatase-1 (SHP-1). Die Relevanz von Zytokinen, epigenetische Methylierung und chronische Stimulation von TRL9 und dem BCR wurde ebenfalls analysiert. Des Weiteren wurde das Potenzial von TRL9 und gemeinsamer TLR9 und BCR- Aktivierung hinsichtlich Proliferation und Differenzierung in Antikörper-sezernierende Zellen (antibody secreting cell, ASC) untersucht. Abschließend wurde der Einfluss von CD40 mit und ohne Interleukin (IL)-4 oder IL-21 Co-Stimulation auf die BCR-vermittelte Syk(Y352) Phosphorylierung und in vitro Proliferation und Differenzierung von B-Zellen untersucht. Dies wurde ergänzt durch Expressionsdaten von ausgesuchten PTPs und PSPs nach CD40/IL-4Co-Stimulation. Es zeigte sich, dass periphere SLE, RA und pSS CD27+ B-Gedächtniszellen eine reduzierte Phosphorylierung der PTKs Syk(Y352) und Btk(Y223) im Vergleich zu gesunden Spendern (healthy donors, HD) aufwiesen. Bemerkenswerterweise war die Syk(Y352)-Phosphorylierung in peripheren CD27- B-Zellen von SLE Patienten und in gewebeansässigen CD27+ B-Zellen von Patienten mit Immunthrombozytopenie (ITP) und pSS, im Vergleich zu nicht-autoimmunen Patienten, ebenfalls reduziert. Im Gegensatz dazu wurden erhöhte Akt(S473)-Phosphorylierungskinetiken in SLE CD27- B-Zellen und CD27+ B-Gedächtniszellen gegenüber HDs gemessen. In pSS und RA CD27- B-Zellen waren diese Kinetiken vergleichbar zu HDs. Die PTP/PSP Aktivität in SLE, sowie die Rekrutierung von SHP-1 zum negativ Co-Rezeptor CD22 von nicht stimulierten peripheren SLE, RA und pSS CD19+ B-Zellen war im Vergleich mit HDs erhöht. Diese Veränderungen des BCR-Signals von SLE, RA und pSS B-Zellen standen nicht im Zusammenhang mit der tonischen Phosphorylierung oder der Expression von Signalmolekülen (Syk, Btk, 1-Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate phosphodiesterase gamma-2 (PLCγ2) und Akt), Zytokinexpression/-stimulation und epigenetischer Programmierung. Jedoch führte die chronische in vitro Stimulation des BCR von gesunden Kontrollen unter Re-Stimulation nach 24, 46 und 72 h, zu einer reduzierten Syk(Y352)-Phosphorylierung. Die TLR9-induzierte Proliferation und Differenzierung zu CD27+CD38+ ASCs von peripheren SLE, RA und pSS CD19+ B-Zellen war im Vergleich zu HDs reduziert. Die kombinierte BCR und TLR9 Aktivierung erhöhte die Proliferation und Differenzierung von SLE, RA und pSS CD19+ B-Zellen nur zu einem bestimmten Maße. In vitro Co-Stimulation von CD40 mit und ohne IL-4 oder IL-21 erhöhte die anti-IgG/IgM induzierte Syk(Y352)-Phosphorylierung in peripheren SLE, RA, pSS und HD B-Zellen. Bemerkenswerterweise konnte die Syk(Y352)-Phosphorylierung in SLE CD27- B-Zellen auf das Niveau von HDs erhöht werden. Des Weiteren führte CD40-Co-Stimulation zu einer hohen Proliferation von SLE, RA, pSS und HD CD19+ B-Zellen. Die Verbesserung der BCR Antwort durch CD40 Co-Stimulation steht dabei im Einklang zu der reduzierten Expression von non-receptor-type PTPs (NRPTPs) wie z. B. tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 2 (PTPN2) und PTPN22, sowie weitere receptor-type PTPs (RPTPs) in HD und SLE CD19+ B-Zellen nach CD40L/IL-4 Co-Stimulation. Im Gegensatz zur generellen Annahme von hyperreaktiven B-Zellen in Autoimmunerkrankungen konnte diese Arbeit zeigen, dass periphere und gewebeansässige B-Zellen von Autoimmunpatienten funktionell beeinträchtigt sind. Dies zeigt sich unter anderem in einer reduzierten BCR- und TLR9-Stimulierbarkeit aufgrund von erhöhter Negativregulation durch PTPs wie z. B. SHP-1. Der ausgeprägteste Phänotyp wurde dabei in SLE B-Zellen beobachtet. Die beobachtete, reduzierte Reaktionsfähigkeit könnte funktionell der Anergie entsprechen und spiegelt wahrscheinlich einen ‚post-Aktivierungsstatus‘ auf Grund von chronischer B-Zellaktivierung und keine generelle Signalabnormität wider. Diese Ergebnisse unterstreichen die Wichtigkeit der Kommunikation von B- und T-Zellen mittels CD40/CD40L Interaktion. Zudem scheint diese Interaktion der Schlüssel für die Reaktivierung von ‚post-aktivierten‘ B-Zellen in Autoimmunerkrankungen via Modulation der PTPs zu sein. Folglich könnten sich aus der Negativregulation von PTPs und B-Zellaktivierung via CD40 neue Perspektiven für Therapiestrategien ergeben.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/12180
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-11054
Exam Date: 20-Nov-2020
Issue Date: 2021
Date Available: 5-Feb-2021
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): B cell receptor
CD40
Toll-like receptor 9
autoimmune diseases
post-activation
B-Zellrezeptor
Autoimmunerkrankungen
Post-Aktivierung
License: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
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