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Main Title: Physiological and enzymatic studies of respiration in Dehalococcoides species strain CBDB1
Author(s): Gopalakrishnan, Jayachandran
Advisor(s): Görisch, Helmut
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Die Dissertation beschreibt die physiologischen und enzymatischen Fähigkeiten von Dehalococcoides sp Stamm CBDB1. Wachstum des Stammes CBDB1 auf Grundlage von Dehalorespiration mit HCB und PeCB konnte gezeigt werden. Diese Ergebnisse stellen ein neues System für die Kultivierung von Stamm CBDB1 mit hochchlorierten Benzolen als Elektronenakzeptoren zur Verfügung. Hydrogenase und Dehalogenase sind die Schlüsselenzyme bei der Dehalorespiration. Beide Enzyme sind membrangebunden mit den katalytischen Zentren nach außen. Hydrogenaseaktivität konnte auch im Cytoplasma gemessen werden. Die Hydrogenase von Stamm CBDB1 ist sehr empfindlich gegenüber Sauerstoff, so verloren die Zellen sofort ihre Enzymaktivität, wenn sie der Luft ausgesetzt waren. Die Aktivität der reduktiven Dehalogenasen in Kulturen von Stamm CBDB1 angezüchet auf verschiedenen Chlorbenzolen weisen darauf hin, dass verschiedene Elektronenakzeptoren unter Umständen unterschiedliche reduktive Dehalogenasen induzieren. Die Dehalogenaseaktivität gemessen an ganzen Zellen mit artifiziellen Elektrondonoren lassen vermuten, dass ein Redoxpotential von ?-360 mV für die Reduktion von Chlorbenzolen benötigt wird. Auch sterische Effekte haben einem Einfluss auf die Dehalogenaseaktivität. So war die Dehalogenaseaktivität, die mit Methylviologen ( E0´=-450 mV) gemessen wurde, höher als die mit Ethylviologen ( E0´=-480 mV). Chinone scheinen als physiologische Elektronenmediatoren in der Transportkette von Stamm CBDB1 auszuscheiden, weil durch HONOQ, einen Inhibitor von Chinon abhängigen Redoxreaktionen, die Dechlorierung in intakten Zellen mit Wasserstoff als Elektronendonor nicht gehemmt werden konnte. Bei Dechlorierungsversuchen mit intakten Zellen und Wasserstoff als Elektronendonor in Gegenwart des Protonophors TCS stellte sich heraus, dass Stamm CBDB1 nicht auf einen reversen Elektronentransport angewiesen ist. 1,2,3,4-TeCB inhibierte die Dechlorierung in Zellkulturen mit Wasserstoff als Elektronendonor. Der genaue Mechanismus der Inhibition ist unbekannt. Es wird vermutet, dass 1,2,3,4-TeCB den Elektronentransport unterbricht, ohne mit der Hydrogenase oder Dehalogenase zu interagieren. Ein putatives Gencluster, bestehend aus den Strukturgenen hupS und hupL, die membrangebundene Gruppe 1 [Ni-Fe] Hydrogenasen codieren, wurde aus Stamm CBDB1 amplifiziert und sequenziert. Das Cluster enthielt außerdem hupD, ein Gen, das ein akzessorisches Protein für die Reifung der Hydrogenase codiert. Die Amplifizierung der drei Gene aus mRNA über RT-PCR bestätigte, dass das Gencluster als polycistronischer Messenger transkribiert wird. Dem amplifizierten Operon fehlte ein Gen, das für Cytochrom b codiert. Dieses Gen existiert in allen bisher bekannten membrangebundenen [Ni-Fe] Hydrogenasen, nicht aber in löslichen Hydrogenasen. Die Hydrogenaseaktivität wurde in der Membranfraktion gemessen. Ein einzigartiges hydrophobes Segment in der kleinen Untereinheit (HupS) der Hydrogenase könnte für das Anhaften an der Membran verantwortlich sein. An diesem Punkt unterscheidet sich das Hydrogenaseoperon von Stamm CBDB1 von den bisher in der Literatur beschriebenen.
The thesis describes physiological properties of Dehalococcoides species strain DBDB1 and enzymes involved in dehalorespiration. Growth of strain CBDB1 with HCB and PeCB provided an efficient system for the cultivation with highly chlorinated benzenes as electron acceptors. The key enzymes, hydrogenase and dehalogenase activities, were membrane associated with catalytic sites oriented towards the outside. Hydrogenase activity was also detected in the cytoplasm. Hydrogenase of strain CBDB1 was found to be highly sensitive to oxygen. Reductive dehalogenase activity detected in cells of strain CBDB1 pregrown with different chlorobenzene congeners as electron acceptors indicated that the different electron acceptors might induce different reductive dehalogenases. Dehalogenase activity of whole cells detected with artificial electron donors indicated that a redox potential of £-360 mV is needed for the chlorobenzenes reduction. However, steric effects also influenced dehalogenase activity because a higher reaction rate of dehalogenase activity was measured with methyl viologen (Eo´= -450 mV) compared to ethyl viologen (Eo´= -480 mV). Quinones seem not to be physiological electron mediators in the electron transport of strain CBDB1, because HONOQ, an inhibitor of quinone dependent redox reactions, did not inhibit the reductive dechlorination reaction by intact cells with hydrogen as electron donor. Dechlorination by intact cells with hydrogen as electron donor in the presence of a protonophore, TCS, revealed that strain CBDB1 does not require reverse electron transport. 1,2,3,4-TeCB strongly inhibited the dechlorination by whole cells with hydrogen as electron donor. The precise mechanism of inhibition by 1,2,3,4-TeCB is unknown. However, 1,2,3,4-TeCB is believed to interfere somehow with a step in the electron transport of strain CBDB1 without inhibiting hydrogenase or dehalogenase activity. The putative gene cluster consisting of structural genes hupS and hupL coding for a membrane bound group-1 [Ni-Fe] hydrogenase was amplified and sequenced. The gene cluster also contained hupD, a gene encoding an accessory protein for hydrogenase maturation. Amplification of all three genes by RT-PCR from mRNA confirms that the investigated gene cluster is transcribed as a polycistronic messenger. The amplified operon lacks a gene coding for cytochrome b that is found in all other membrane bound [Ni-Fe] hydrogenases known so far, but is not present in soluble hydrogenases. However, based on the hydrogenase activity in the membrane fraction, a unique hydrophobic segment found in the small subunit (HupS) of the hydrogenase could be responsible for attaching the complex to the membrane. In this aspect, the hydrogenase operon of strain CBDB1 differs from all other membrane bound hydrogenase operons described so far.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-8578
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1254
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-957
Exam Date: 23-Jun-2004
Issue Date: 8-Nov-2004
Date Available: 8-Nov-2004
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Anaerobic respiration
CBDB1
Chlorobenzenes
Dehalococcoides
Elecetron tranport chain
Hydrogenase.
Anaerobic respiration
CBDB1
Chlorobenzenes
Dehalococcoides
Elecetron tranport chain
Hydrogenase.
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