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Main Title: Design and utilization of NADH sensors in bacterial cells, specifically to monitor activity of the soluble hydrogenase of Ralstonia eutropha
Translated Title: Konstruktion und Anwendung von NADH Biosensoren in bakteriellen Zellen, speziell zur Beobachtung der Aktivität der löslichen Hydrogenase aus Ralstonia eutropha
Author(s): Wilkening, Svea Kristina
Advisor(s): Friedrich, Thomas
Referee(s): Friedrich, Thomas
Budisa, Nediljko
Schmitt, Franz-Josef
Granting Institution: Technische Universität Berlin
Type: Doctoral Thesis
Language Code: en
Abstract: The soluble hydrogenase (SH) of R. eutropha is a potential candidate for application in clean energy generation in a post-fossil age. In order to elucidate its mode of action, and possibly deduce general parameters for a biotechnological implementation, it is desirable to monitor the protein in vivo. The hydrogenase couples the oxidation of H2 to the reduction of NAD+ to NADH, offering the possibility of observing the SH activity by fluorescent NADH sensors. Many different fluorescent NADH sensors have been designed the past years. Frex is a prototypical NADH sensor, consisting of a bacterial NADH-sensing repressor protein and a circularly permuted yellow fluorescent protein. The utilization of fluorescence spectroscopy offers the opportunity to observe whole cells with low perturbation and without disruption. By expressing the Frex biosensor in various strains of R. eutropha, either containing or devoid of SH, the sensor gives information of the intracellular NADH pool, and the alterations due to the SH activity. The experiments indicated a correlation between the activity of the SH and the duration of elevated Frex fluorescence in R. eutropha cells, making the sensor a suitable tool to examine SH activity in vivo. Since NADH is a paramount cofactor for many reactions in cells, the readout of its intracellular concentration is of great interest. However, so far designs of NADH biosensors have been limited by the fact that these were created for an application in mammalian cells. In consequence, transfer of these sensors to bacterial cells is not easily achieved, considering their different, generally higher, NADH and NAD+ levels. The infrared fluorescent protein (iRFP713) was investigated regarding its behavior in presence of NADH. In these experiments, an excitation energy transfer was detected, in which the protein’s tryptophan residue(s) transmit excitation energy towards the biliverdin chromophore. This EET process was impeded by the presence of NADH, effectively exhibiting a promising detection mode for a far-red fluorescent NADH sensor. Since iRFP713 cannot discriminate between NADH and its analogues, an experimental strategy to attach iRFP713 to NADH-sensing Rex subunits was constructed. The resulting Bili-Sense sensor also exhibited the EET process, which was disruptable by NADH, and time-resolved fluorescence spectroscopy revealed that the quenching of the sensor by NADH was of both dynamic and static nature.
Die NAD+-reduzierende Hydrogenase aus R. eutropha ist ein potentieller Kandidat für die Generierung von Wasserstoff als alternativen Energieträger in einem postfossilen Zeitalter. Die SH kombiniert die Oxidation von H2 mit der Reduktion von NAD+ zu NADH, welches die Möglichkeit eröffnet, die Aktivität des Enzyms über fluoreszierende NADH-Sensoren zu verfolgen. Frex ist ein NADH-Reporter, der aus einer bakteriellen NADH-sensitiven Einheit eines bakteriellen Repressorproteins und einem zyklisch permutierten gelb-fluoreszierenden Protein besteht. Die Fluoreszenzspektroskopie ermöglicht die Beobachtung ganzer Zellen unter minimal-invasiven Bedingungen. Durch das Einbringen des Frex Sensors in einen R. eutropha Stamm, welcher fähig ist die SH zu exprimieren, und dem Vergleich der Fluoreszenzantwort mit einem Stamm, dem dies nicht möglich ist, kann der Sensor Informationen über den intrazellulären NADH Speicher liefern, und folglich lässt die Analyse dieser Daten Rückschlüsse bezüglich der Aktivität der SH zu. Die so gestalteten Experimente zeigten eine Korrelation der Aktivität der SH und der Dauer der erhöhten Fluoreszenz des Reporters auf. Frex ist somit ein geeignetes Hilfsmittel, um die SH-Aktivität in vivo zu untersuchen. NADH ist ein fundamentaler Cofaktor, der an einer Vielzahl von Prozessen und Reaktionen in biologischen Zellen beteiligt ist. Die Bestimmung der intrazellulären Konzentration dieses Stoffes ist daher von größtem Interesse. Bisher wurden NADH-Sensoren ausschließlich für die Anwendung in Säugerzellen generiert. Aufgrund der stark abweichende NAD+ und NADH Konzentrationen ist die Anwendung dieser Sensoren in Bakterien nicht trivial. Das Infrarot-fluoreszierende Protein iRFP713 wurde hinsichtlich seiner Interaktion mit NADH untersucht, wobei festgestellt wurde, dass ein Anregungsenergietransferprozess (EET) zwischen einem oder mehreren Tryptophanen und dem Chromophor des Proteins auftritt. Dieser EET wird durch NADH konzentrationsabhängig gestört. Da iRFP713 selbst keine Möglichkeit hat, zwischen NADH und anderen verwandten Molekülen zu selektieren, wurde die Fluoreszenzsonde mit den Rex-Untereinheiten aus B. subtilis versehen. Spektroskopische Untersuchungen des so entstandenen Sensors Bili-Sense zeigten, dass der EET in dem Protein konserviert ist. Zudem wurde mittels zeitaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie ermittelt, dass der Prozess der Fluoreszenzlöschung durch NADH sowohl statische wie auch dynamische Komponenten enthält.
URI: https://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/12900
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-11701
Exam Date: 25-Mar-2021
Issue Date: 2021
Date Available: 20-Apr-2021
DDC Class: 541 Physikalische Chemie
Subject(s): NADH biosensor
hydrogenase
fluorescence spectroscopy
time-resolved fluorescence spectroscopy
Hydrogenase
Fluoreszenzspektroskopie
zeitaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie
License: https://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/
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