Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-12049
For citation please use:
Full metadata record
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisorBudisa, Nediljko-
dc.contributor.authorTolle, Isabella-
dc.date.accessioned2021-07-16T13:50:26Z-
dc.date.available2021-07-16T13:50:26Z-
dc.date.issued2021-
dc.identifier.urihttps://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/13257-
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.14279/depositonce-12049-
dc.description.abstractBillions of years of evolution have produced extant living organisms with a vast biodiversity and the ability to adapt to changing environments. At the foundation of it all lies the central dogma of molecular biology, according to which the information flows from the information storage polymer DNA to RNA (“informational polymers”), which is finally translated into proteins (“catalytic polymers”). This fundamental translation process relies on the universal standard genetic code, that assigns nucleobase triplets to the 20 proteinogenic amino acids. However, even after some six decades of research and the formulation of various theories and models, the origin and evolution of the standard genetic code remain an enigma and a comprehensive and conclusive story has yet to be assembled. The discovery of the 21st and 22nd amino acids selenocysteine and pyrrolysine imply a certain flexibility of the genetic code, which is further affirmed by the co-translational incorporation of over 200 noncanonical amino acids (ncAAs) into proteins over the last decades, culminating in the proteome-wide replacement of the latest addition to the genetic code, Trp, with its close structural analog L β (thieno[3,2 b]pyrrolyl)alanine (3,2[Tpa]). During this study, it was attempted to further alienate this strain, designated as TUB170, from life as we know it, by turning a tolerance towards [3,2]Tpa into an addiction. In TUB170 [3,2]Tpa incorporation relies on the catalytic promiscuity of the endogenous tryptophanyl-tRNA synthesis, which, in addition to charging its cognate tRNA with the canonical amino acid Trp, also charges the analog [3,2]Tpa to said tRNA. By replacing this enzyme with an enzyme capable of discriminating between these two amino acids, a biocontained organism dependent on a synthetic nutrient might be engineered. To this end, multiple enzyme libraries from different organisms were designed and assembled via site-saturation mutagenesis as well as error-prone PCR. They were screened employing diverse experimental parameters with varying stringencies. Nevertheless, an aminoacyl-tRNA synthetase that exclusively incorporates [3,2]Tpa could not be selected, which might be attributed to the close structural resemblance of the analog to its counterpart Trp, as this is what drove the choice of analog for the adaptation experiment of TUB170. Another approach towards the creation of synthetic life might be through the replacement of further canonical amino acids, thereby advancing our understanding of the genetic code and its flexibility, as well as the interplay of diverse cellular processes. For the adaptation of an E. coli strain towards utilization of Met analogs, a Met-auxotrophy robust under all cultivation conditions was established in the laboratory wildtype strain MG1655. Furthermore, this strain was optimized for ethionine (Eth) turnover to S-adenosyl ethionine to promote transethylation reactions as a substitute for transmethylation, as Met functions as the precursor for the major cellular methyl donor. After 31 passages of continuous cultivation, an increase in general fitness could be observed, as evinced by a more stable number of colony forming units compared to those produced prior to the adaptation. These results suggest that adaptation of a strain tolerant towards the replacement of methionine with its synthetic counterpart ethionine might be feasible.en
dc.description.abstractMilliarden von Jahren der Evolution haben Lebewesen mit einer erstaunlichen Variation und der Fähigkeit, sich ständig wechselnden Umgebungen und Lebensbedingungen anzupassen, hervorgebracht. Das Fundament dieses Lebens liegt beim zentralen Dogma der Molekularbiologie, nach dem die Information ausgehend vom informationsspeichernden Polymer DNS über die RNS („Informationspolymere“) fließt und letztendlich in ein Protein („katalytisches Polymer“) übersetzt wird. Diesem fundamentalen Übersetzungsprozess, der Proteintranslation, liegt der universale genetische Code zugrunde, welcher Basentripletts den 20 proteinogenen Aminosäuren zuordnet. Allerdings bleiben die Entstehung und Evolution des genetischen Codes trotz sechs Jahrzehnten der Forschung und der Formulierung zahlreicher Theorien und Modelle weiterhin ein Mysterium. Die Entdeckungen der 21. und 22. Aminosäuren, Selenocystein und Pyrrolysin, implizieren eine gewisse Flexibilität des genetischen Codes, welche weiterhin durch den co-translationalen Einbau von über 200 nichtkanonischen Aminosäuren (nkAS) in Proteine bestätigt wird und im proteomweiten Austausch der kanonischen Aminosäure Trp mit ihrem strukturellen Analogon L β (Thieno[3,2 b]pyrrolyl)alanin (3,2[Tpa]) kulminiert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde versucht, die Toleranz dieses Stammes zur synthetischen Aminosäure [3,2]Tpa in ein Abhängigkeitsverhältnis umzuwandeln und den Stamm dabei weiter von einem natürlichen zu einem synthetischen Organismus zu verfremden. In diesem als TUB170 bezeichneten Stamm beruht der Einbau der nichtkanonischen Aminosäure auf der Tatsache, dass das endogene Enzym Tryptophanyl-tRNA-Synthetase zusätzlich zum natürlichen Substrat Trp, auch das Analogon [3,2]Tpa auf die zugehörige tRNA lädt. Durch den Austausch dieses Enzyms mit einem Enzym, welches zwischen den beiden Aminosäuren diskriminieren kann, könnte ein Organismus erschaffen werden, welcher zum Überleben vollständig von einem synthetischen Substrat abhängig ist. Hierzu wurden mehrere Enzymbibliotheken aus unterschiedlichen Organismen entworfen und mit Hilfe verschiedener Mutationstechniken generiert. Diese Bibliotheken wurden anschließend unter der Variation diverser Versuchsparameter gescreent. Jedoch konnte keine Aminoacyl-tRNA-Synthetase, welche ausschließlich [3,2]Tpa einbaut, selektiert werden. Dies ist möglicherweise der großen strukturellen Ähnlichkeit des Analogons zu seinem Gegenstück Trp zuzuschreiben, welche die Wahl auf dieses spezifische Analogon für das Adaptationsexperiment lenkte. Eine andere Herangehensweise zur Erschaffung synthetischen Lebens könnte die Substitution weiterer kanonischer Aminosäuren sein, wodurch wir unser Verständnis des genetischen Codes und seiner Flexibilität, sowie des Zusammenspiels verschiedener zellulärer Prozesse vorantreiben könnten. Zur Adaptation E. colis an Methionin-Analoga wurde eine Met-Auxotrophie im Wildtypstamm MG1655 etabliert, welche unter allen Kultivierungsbedingungen robust ist. Weiterhin, wurde dieser Stamm zur Umsetzung Ethionins in S-Adenosylethionin optimiert, um die Substitution von Transmethylierungsreaktionen durch Transethylierungen zu unterstützen, da Met als Vorstufe des Haptmethyldonors fungiert. Nach 31 Passagen fortlaufender Kultivierung, konnte über eine stabilere Anzahl der koloniebildenden Einheiten in der Gegenwart von Ethionin eine Verbesserung der allgemeinen Fitness beobachtet werden. Diese Ergebnisse suggerieren, dass eine Adaptation E. colis an das synthetische Substrat Ethionin möglich sein könnte.de
dc.language.isoenen
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/en
dc.subject.ddc579 Mikroorganismen, Pilze, Algende
dc.subject.otherncAAen
dc.subject.othergenetic code engineeringen
dc.subject.otherAdaptive Laboratory Evolutionen
dc.subject.otherALEen
dc.subject.otherprotein engineeringen
dc.subject.otheraaRSen
dc.subject.otherevolutionäre Adaptationde
dc.titleTowards the creation of synthetic Escherichia coli via Tryptophan and Methionine substitutionsen
dc.typeDoctoral Thesisen
tub.accessrights.dnbfreeen
tub.publisher.universityorinstitutionTechnische Universität Berlinen
dc.contributor.grantorTechnische Universität Berlinen
dc.contributor.refereeBudisa, Nediljko-
dc.contributor.refereeFriedrich, Thomas-
dc.contributor.refereeIgnatova, Zoya-
dc.date.accepted2021-06-04-
dc.title.translatedErzeugung synthetischer Escherichia coli Stämme durch Tryptophan und Methionin Substituierungde
dc.type.versionacceptedVersionen
Appears in Collections:FG Biokatalyse » Publications

Files in This Item:
tolle_isabella.pdf
Format: Adobe PDF | Size: 6.71 MB
DownloadShow Preview
Thumbnail

Item Export Bar

Items in DepositOnce are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.