Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1060
Main Title: Biochemische und molekularbiologische Untersuchung reduktiver Dehalogenasen aus Dehalococcoides sp. Stamm CBDB1
Translated Title: Biochemical and genetic studies on reductive dehalogenases of Dehalococcoides sp. strain CBDB1
Author(s): Hölscher, Tina
Advisor(s): Görisch, Helmut
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Die vorliegende Arbeit beschreibt Eigenschaften der reduktiven Chlorbenzol-Dehalogenase aus Dehalococcoides sp. Stamm CBDB1, einem strikt anaeroben Bakterium, das Chlorbenzole als terminale Elektronenakzeptoren zur Energiegewinnung nutzt. 1,2,3-Trichlorbenzol (TCB), 1,2,4-TCB, alle Tetrachlorbenzol-Isomere, Pentachlorbenzol und Hexachlorbenzol wurden durch Rohextrakt von Stamm CBDB1 reduktiv dechloriert. Besonders hohe spezifische Aktivitäten konnten für 1,2,3,4-Tetrachlorbenzol und Pentachlorbenzol mit Methylviologen als Elektronendonor nachgewiesen werden. Die lichtreversible Hemmung durch Alkyliodide ließ auf eine Beteiligung von Cob(I)alamin an der reduktiven Dechlorierung von 1,2,3-TCB schließen. Die 1,2,3-TCB-Dehalogenase-Aktivität war mit der Membranfraktion assoziiert. Hohe Dechlorierungsaktivitäten intakter Zellen mit dem hydrophilen Elektronendonor Methylviologen wiesen auf eine extrazelluläre Orientierung der TCB-Dehalogenase hin. Aufgrund der geringen Proteinerträge aus CBDB1-Kulturen (<1 µg Protein/ml) wurden gelelektrophoretische Methoden für die Proteinaufreinigung eingesetzt. Mit Hilfe von nativen, Taurodesoxycholat enthaltenden Polyacrylamidgelen wurden solubilisierte Membranproteine aufgetrennt, und einer einzelnen Proteinbande konnte Dehalogenase-Aktivität zugeordnet werden. Eine Analyse über Tandem-Massenspektrometrie lieferte aufgrund der geringen Proteinmenge keine verwertbare Aminosäure-Sequenz formation. Bindungsversuche mit immobilisierten rekombinanten B-Proteinen aus Stamm CBDB1 gaben Hinweise darauf, dass Dehalogenasen spezifisch mit Membranankerproteinen interagieren und eine Aufreinigung von Dehalogenasen über diese Interaktion möglich ist. Aus genomischer DNA von Stamm CBDB1 und dem Trichlorethen (TCE) dechlorierenden Bakterium Dehalococcoides sp. Stamm FL2 wurden jeweils 14 verschiedene reduktive Dehalogenase-homologe (RDH)-Gene über PCR amplifiziert, die mit RDH-Genen von Dehalococcoides ethenogenes Stamm 195 und Dehalococcoides sp. Stamm BAV1 sowie dem TCE-Dehalogenase kodierenden tceA-Gen von Stamm 195 einen Gencluster bildeten. Die Sequenzbeziehungen der RDH-Gene lassen eine frühe Evolution der reduktiven Dehalogenasen vermuten. Mit Hilfe von vergleichenden Sequenzanalysen konnten Consensussequenzen zur Cobalaminbindung in den abgeleiteten Aminosäuresequenzen von sieben RDH-Genen identifiziert werden.
The present work describes properties of the chlorobenzene reductive dehalogenase from Dehalococcoides sp. strain CBDB1, a strictly anaerobic bacterium that uses chlorinated benzenes as terminal electron acceptors to meet its energy needs. 1,2,3-trichlorobenzene (TCB), 1,2,4-TCB, all tetrachlorobenzene isomers, pentachlorobenzene and hexachlorobenzene were reductively dechlorinated by crude extracts of strain CBDB1. Exceptionally high specific activities were obtained for 1,2,3,4-tetrachlorobenzene and pentachlorobenzene with methyl viologen as electron donor. Light-reversible inhibition by alkyl iodides indicated the involvement of cob(I)alamin in reductive dechlorination of 1,2,3-TCB. 1,2,3-TCB dehalogenase activity was associated with the membrane fraction. High dechlorinating activities of intact cells with the hydrophobic electron donor methyl viologen suggested an extracellular orientation of the TCB dehalogenase. Owing to low protein yields of CBDB1 cultures (<1 µg protein/ml) gel electrophoretic methods were applied for protein purification. Using native polyacrylamide gels containing taurodeoxycholate, solubilized membrane proteins were separated and dehalogenase activity could be assigned to a single protein band. Due to the low amount of protein, tandem mass spectrometry did not yield useful amino acid sequence information. Binding studies with immobilized recombinant B proteins from strain CBDB1 suggested that dehalogenases specifically interact with membran anchoring proteins and that purification of dehalogenases via this interaction is feasable. From genomic DNA of strain CBDB1 and the trichloroethene (TCE) dechlorinating bacterium Dehalococcoides sp. strain FL2, 14 different reductive-dehalogenase-homologous (RDH) genes were PCR-amplified that formed a gene cluster with the RDH genes from Dehalococcoides ethenogenes strain 195 and Dehalococcoides sp. strain BAV1 as well as the TCE dehalogenase encoding tceA gene from strain 195. Sequence relationships of RDH genes suggested an early evolution of reductive dehalogenases. Comparative sequence analysis revealed the presence of cobalamin binding consensus sequences in deduced amino acid sequences of seven RDH genes.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-9606
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1357
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1060
Exam Date: 2-Feb-2005
Issue Date: 17-Feb-2005
Date Available: 17-Feb-2005
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Anaerobe Atmung
CBDB1
Chlorbenzole
Dehalococcoides
Reduktive Dehalogenase
Anaerobic respiration
CBDB1
Chlorobenzenes
Dehalococcoides
Reductive dehalogenase
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