Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1082
Main Title: Structural and functional investigations of Photosystem II from Thermosynechococcus elongatus
Translated Title: Strukturelle und funktionelle Untersuchungen an Photosystem II aus Thermosynechococcus elongatus
Author(s): Kern, Jan
Advisor(s): Zouni, Athina
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Die oxygene Photosynthese ist neben der Atmung der bedeutendste biologische Energieumwandlungprozess. Sie generiert den gesamten atmosphärischen Sauerstoff und fast alle Nährstoffe für nicht-photosynthetische Organismen. Die lichtinduzierte oxidative Spaltung von Wasser findet in Photosystem II (PSII) statt, einem in Thylakoidmembranen von Pflanzen, Algen und Cyanobakterien vorkommendem Pigment-Protein-Komplex. Die Kenntniss der Struktur des PSII Enzymkomplexes ist eine Voraussetzung für ein tieferes Verständniss dieses Prozesses. In der vorliegenden Arbeit wurde eine schnelle Reinigungsmethode für PSII-Core Komplexe (PSIIcc) aus den Thylakoidmembranen des Cyanobakteriums Thermosynechococcus elongatus entwickelt. Monomere (M) und dimere (D) Formen des PSIIcc konnten in hohen Ausbeuten separiert werden. Der Oligomerisationszustand des Proteins wurde mit Hilfe von Gelfiltration, dynamischer Lichtstreuung und analytischer Ultrazentrifugation untersucht, wobei Größen von 440 kDa und 760 kDa für PSIIccM und D erhalten wurden. PSIIccM und D wurden auf ihre photochemische Aktivität, Sauerstoffentwicklungsaktivität, sowie ihre Pigment-, Lipid- und Detergenszusammensetzung untersucht. Es wurden Werte von 36 Chla, 2 Pheoa, 9 ?-Car, 2.9 PQ9, 3.8 Mn, 10 Lipide, 110 ?-DM pro photochemischem Zentrum und Sauerstoffaktivitäten von 3000 µmol O2/(mg Chla h) erhalten, wobei sich PSIIccM und D nicht merklich unterschieden. Die Polypeptidzusammensetzung wurde mit Hilfe von Gelelektrophorese, N-terminaler Sequenzierung und Massenspektrometrie untersucht. In beiden Formen wurden die 19 Untereinheiten PsbA, B, C, D, E, F, H, I, J, K, L, M, O, T, U, V, X, Y und PsbZ gefunden. Von PSIIccD konnten Kristalle gezüchtet werden, deren Sauerstoffentwicklungsaktivität, Untereinheitenzusammensetzung und Pigmentstöchiometrie denen des gelösten PSIIccD entsprachen. Einkristalle des PSIIccD wurden mit Hilfe von EPR und XAS spektroskopisch untersucht. Hochfeld-EPR am dunkelstabilen Tyrosinradikal TyrD? und transienten EPR am licht-induzierten Triplettzustand 3P680 erbrachten Informationen über die dreidimensionale Orientierung der entsprechenden Kofaktoren. Zur Untersuchung des Oxidationszustandes und der Orientierung des Mn-Clusters wurden Röntgenabsorptionsmessungen an den Kristallen durchgeführt und die Anwendbarkeit dieser Methode auf PSII-Einkristalle gezeigt. Die anfangs erhaltenen Kristalle zeigten Röntgenbeugung bis zu einer Auflösung von 3.8 Å die bis auf 3.2 Å verbessert werden konnte. Bei 3.8 Å Auflösung konnten die membran-ständigen Untereinheiten D1, D2, CP43, CP47 (PsbA-D) und cyt b559 (PsbE, F) sowie die beiden membranextrinsischen Untereinheiten PsbO und PsbV lokalisiert werden. Für die Kofaktoren der Elektronentransportkette wurde eine symmetrische Anordnung entlang zweier Äste gefunden. Eine dem Mn-Cluster zuzuordnende Elektronendichte wurde auf der lumenalen Seite von D1 beobachtet, aus deren Form auf eine "3+1" Anordnung der Mn-Ionen geschlossen werden konnte. Bei 3.2 Å Auflösung konnte die Mehrzahl der Aminosäureseitenketten zugeordnet werden, die meisten der lumenalen Bereiche von D1, D2, CP43, CP47 sowie die extrinsische Untereinheit PsbU wurden modelliert, und Informationen über die Bindungstaschen der Kofaktoren sowie mögliche Wasserstoffbrückenbindungen gewonnen. Ein ?-Carotin wurde in der Nähe des Cyt b559 identifiziert und ein Ca2+ in der Nachbarschaft des Mn-Clusters zugeordnet. Einige der Mn-Liganden konnten eindeutig bestimmt werden. Die vorliegende Arbeit stellt einen wichtigen Schritt hin zur Erlangung von PSII Einkristallen dar, die über ausreichende Röntgenbeugungsqualitäten verfügen um ein genaueres Verständ-niss des Mechanismus der biologischen Wasserspaltung in PSII zu ermöglichen.
Oxygenic photosynthesis is one of the largest biological energy converting processes on earth, providing all atmospheric oxygen and nutrients, consumed by non photosynthetic organisms. The light driven cleavage of water takes place in photosystem II (PSII), a large multi subunit pigment protein complex embedded in the thylakoid membrane of cyanobacteria, algae and higher plants. For a more detailed understanding of the molecular process of water oxidation an elucidation of the structure of this enzyme is a prerequisite. In the present work a fast, large scale purification method was developed for PSII core complexes (PSIIcc) from the thylakoid membranes of the cyanobacterium Thermosynechococcus elongatus. Monomeric and dimeric forms of PSIIcc could be separated and about 140 mg dimeric and 90 mg monomeric PSIIcc could be obtained from the extract of 100 g cells. For the determination of the oligomerization state the two forms were characterised by a combination of gel permeation chromatography, light scattering and analytical ultracentrifugation, yielding sizes of 440 kDa and 760 kDa, respectively and confirming assignment of the two forms to monomeric and dimeric PSIIcc. Monomeric and dimeric PSIIcc were characterised with respect to photochemical and oxygen evolution activity, to pigment, lipid and detergent composition, giving values of 36 Chla, 2 Pheo, 9 ?-Car, 2.9 PQ9, 3.8 Mn, 20 lipids, 110 ?-DM per photochemical center, with activities of 3000 µmol O2/(mg Chla h). No significant differences were found between monomeric and dimeric PSIIcc. The subunit composition was investigated by SDS-PAGE, MALDI-TOF MS and N-terminal sequencing, showing the presence of 19 subunits in both forms of PSII: PsbA, B, C, D, E, F, H, I, J, K, L, M, O, T, U, V, X, Y and PsbZ. The dimeric PSIIcc was used for crystallisation experiments. The obtained redissolved crystals showed the same subunit and pigment composition as found for PSIIcc prior to crystallisation and they showed full photochemical and oxygen evolving activity. PSIIcc single crystals were used for orientation dependent spectroscopy. High field EPR on the dark stable TyrD? and transient EPR on the light induced 3P680 in the crystals yielded 3D orientational information on the corresponding cofactors. X-ray absorption measurements on the crystals were used to characterise the oxidation state of the Mn-cluster and investigate the dichroism of the EXAFS signal, demonstrating the applicability of this method to PSII crystals and complementing information derived by X-ray spectroscopy. Initially crystals diffracting X-rays up to 3.8 Å resolution could be obtained, which were further improved to a maximum resolution of 3.2 Å. The structure of PSIIcc at 3.8 Å resolution showed the arrangement of the 4 large membrane intrinsic subunits D1, D2, CP43, CP47 (PsbA-D), the intrinsic cyt b559 (PsbE, F) and the two extrinsic subunits PsbO and PsbV. The positions of all cofactors of the electron transfer chain could be derived, showing a symmetrical arrangement in two branches. The Mn-cluster could be localised at the lumenal side of D1, the shape of its electron density suggesting a "3+1" arrangement of the Mn-ions. At 3.2 Å resolution the majority of the amino acid side chains, most of the extrinsic regions, including PsbU and loops of D1, D2, CP43 and CP47 were traced and the binding pockets of the various cofactors as well as some H-bond interactions could be derived. One ?-Car could be identified next to cyt b559, Ca2+ could be localised close to the Mn-cluster, and some of the Mn-ligands could be identified unambiguously. The here described work is an important step towards future improvements in the quality of PSII crystals which will provide a structure of PSIIcc of sufficient resolution for supporting the elucidation of the water oxidising mechanism of this enzyme.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-9828
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1379
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1082
Exam Date: 26-Jan-2005
Issue Date: 5-Apr-2005
Date Available: 5-Apr-2005
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Photosynthese
Photosystem II
Struktur
Wasseroxidation
Membranprotein
Photosynthesis
Photosystem II
structure
water oxidation
membrane protein
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