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Main Title: Strukturelle Untersuchungen an der Ribonukleotid Reduktase und der Pyruvat:Ferredoxin Oxidoreduktase mittels ESR und ENDOR Spektroskopie
Translated Title: Structural investigations on Ribonucleotide Reductase and Pyruvate:Ferredoxin Oxidoreductase via EPR and ENDOR Spectroscopy
Author(s): Galander, Marcus
Advisor(s): Lendzian, Friedhelm
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Radikale sind als transiente Intermediate aktive Bestandteile der katalytischen Funktion vieler Enzyme. Radikalenzyme treiben einen großen Bereich biologischer Reaktionen. Diese Reaktionen sind mit spezifischen lokalen und strukturellen Änderungen des jeweiligen Enzyms verbunden. Deren Kenntnis ist für das Verständnis des Reaktionsmechanismus von entscheidender Bedeutung. Aufgrund ihrer kurzen Lebendsdauer und ihrer hohen Reaktivität ist die Konformation von Radikalintermediaten der Röntgenstrukturanalyse jedoch meist unzugänglich. Im Rahmen dieser Arbeit wird gezeigt, wie durch die Kombination von ESR und ENDOR Spektroskopie Methoden strukturelle Aussagen über Konformation aktiver Radikalintermediate gewonnen werden können. Die Reduktion von Ribonukleotid zu Deoxyribonukleotid durch die Ribonukleotid Reduktase wird von einem aktiven Tyrosinradikal in unmittelbarer Nähe eines zweikernigen Eisenzentrums (Fe(III)-Fe(III)) initiiert. Im ersten Teil dieser Arbeit wird das Tyrosinradikal mit einer Ausbeute von 10% in Einkristallen von der Untereinheit R2 in Escherichia coli und in Salmonella typhimurium erzeugt und untersucht. Die Orientierung des aktiven Tyrosinradikals gegenüber der inaktiven reduzierten Form der Röntgenstrukturanalyse wird erstmalig mit Hochfeld Einkristall-ESR bestimmt. Des weiteren werden gekoppelte Eisenzentren und gekoppelte Eisen-Radikalzentren der Radikalgenerierungsreaktion in der Ribonukleotid Reduktase mit Hilfe von ESR und 14N, 1H und 57Fe ENDOR untersucht. In einigen Mutanten von R2 E.coli werden nach der Reaktion des zweikernigen Eisenzentrums mit molekularem Sauerstoff stabile paramagnetische Zentren beobachtet, ohne dass es zur Ausbildung des aktiven Tyrosinradikals kommt. Das paramagnetische Zentrum
Transient radical intermediates are essential for the catalytic function of various enzymes in a wide range of biological reactions. The formation of these radical intermediates during the catalytic cycle of these enzymes is induced by specific local structural changes of the protein. These local structural changes are of high interest to understand the catalytic mechanism, they are usually not detectable by x-ray crystallography. This work demonstrates the possibilities to detect conformational changes during the formation of active radical intermediates by a combination of EPR and ENDOR techniques. The reduction of ribonucleotides to the corresponding deoxyribonucleotides by the ribonucleotide reductase is initiated by a stable tyrosyl radical nearby a diiron center in the Fe(III)-Fe(III) state. The first part of this work describes the possibility to generated the tyrosyl radical in single crystals of R2 Escherichia coli and R2F Salmonella typhimurium with a total amount of 10%. For the first time the reorientation of the active tyrosyl radical with respect to the inactive met form of the x-ray structure is obtained by single-crystal high-field EPR. In the following part of the work coupled diiron centers and coupled diiron-radical centers during the radical generating reaction of ribonucleotide reductase are investigated by EPR and 14N, 1H and 57Fe ENDOR. Some mutants of R2 E.coli contain different paramagnetic centers without the formation of the active tyrosyl radical. In this work the paramagnetic center
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-10873
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1482
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1185
Exam Date: 12-Jul-2005
Issue Date: 2-Sep-2005
Date Available: 2-Sep-2005
DDC Class: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Subject(s): ENDOR
EPR
PFOR
RNR
ENDOR
EPR
PFOR
RNR
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