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Main Title: Impact of environmental factors on viability and stability and high pressure pretreatment on stress tolerance of Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) during spray drying
Translated Title: Einfluss von Umgebungsfaktoren auf die Ueberlebensrate und Stabilität sowie Auswirkung von Hochdruckvorbehandlung auf die Stresstoleranz von Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) bei Sprühtrocknung
Author(s): Ananta, Edwin
Advisor(s): Knorr, Dietrich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Diese Arbeit befasst sich in erster Linie mit der Evaluierung der Anwendbarkeit von Sprühtrocknung als eine alternative Methode zur Herstellung von Probiotika enthaltenden Trockenpräparaten. Dazu wurden optimale Trocknungsbedingungen ermittelt und die verwendeten Schutzmedien auf thermo-physikalische Beschaffenheit und Wechselwirkung mit einem synthetischen Membransystem untersucht. Eine Trocknungstemperatur von 80 °C wurde als ein annehmbarer Kompromiss ermittelt. Bei dieser Temperatur ließ sich eine probiotische Pulverzubereitung auf Milchbasis mit einer Restfeuchte von 4 Prozent und einem Keimgehalt von ca. 109 Zellen pro g herstellen. Der Auswahl des Trägermediums wurde eine große Rolle zugeschrieben, da dies das Überlebensverhalten während der Lagerzeit determiniert, was letztlich das Qualitätsmerkmal der probiotischen Produkte und somit die gesundheitsfördernde Wirkung vom Probiotikaverzehr beeinflußt. Obwohl partieller Austausch der Magermilch durch kommerzielle präbiotische Substanzen unter Beibehaltung einer konstanten Trägerstoffkonzentrationen keinen negativen Einfluss auf die unmittelbare Überlebensrate von Lactobacillus rhamnosus GG bei der Sprühtrocknung hatte, fand im Vergleich zu Magermilch eine stärkere Keimzahlreduktion in den beiden präbiotischen Kombinationspräparaten während der Lagerung bei 37°C statt. Desweiteren wurde festgestellt, dass das Vorliegen des Glaszustandes in dem Trägermaterial nur eine untergeordnete Rolle bei der Gewährleistung der Lagerstabilität der darin befindlichen Keime spielt. Die unterschiedliche Schutzwirkung der verwendeten Trägermaterialien müssen vielmehr in der räumlichen bzw. chemischen Struktur der Schutzmoleküle liegen, die wiederum Einfluss nehmen auf die Art und Weise, wie sie mit Zellmembranen bzw. ihre Bestandteile in Wechselwirkung treten. Diese Sicht wurde durch weitere Arbeit mit der Trocknung von den als Modellsystem für Doppellipidmembran dienenden Liposomen im Beisein von Zuckermolekülen bestätigt. Ferner wurde zur weiteren Klärung über den herausragenden Schutzeffekt von Magermilch auf die Lagerstabilität getrockneter Bakterien der Einfluss von Milchproteinen untersucht. Es zeigte sich, dass bei der Lagerung die Keimzahlreduktion bei Bakterien in proteolytisch behandelter Magermilch wesentlich schneller erfolgte als die in nativer Magermilch. Unterstützend wurde an einer analytischen Methode zur Charakterisierung der Zellschädigung während der Sprühtrocknung gearbeitet. Dazu wurde die durchflußzytometrische Analysenmethode verwendet. Dies benötigt entsprechende Färbungs- und Messungsstrategie, die im Vorfeld etabliert werden musste. Bei der Etablierungsphase wurde die Methode eingesetzt zur Beurteilung der Art und des Ausmaßes der zellulären Schädigung, die unter Anwendung verschiedener physikalischer Behandlung, wie beispielsweise Hochdruck-, Hitze-, oder Ultraschallbehandlung an den Zellen von L. rhamnosus GG herbeigeführt wurde. Dafür wurde die Farbstoffkombination Carboxyfluorescein-diacetat und Propidiumiodid angewandt. Es zeigt sich, dass während bei der Hitzebehandlung oberhalb 60°C der Verlust der Membranintegrität als primäre Ursache des hitzebedingten Zelltodes ausgemacht werden konnte, führte offensichtlich die irreversible Schädigung der membrangebundenen Enzymsysteme zum hochdruckinduzierten Zelltod. Anders als die hitzegetöteten Zellen bestand die Population der druckinaktivierten Zellen hauptsächlich aus Zellen, die noch intakte Membranen und aktives intrazellüläres Enzym besitzen. Hinsichtlich der Inaktivierung von L. rhamnosus GG während Sprühtrocknung führten den Ergebnissen zufolge höhere Temperaturen während der Trocknung zu stärkeren Schäden in der Zellmembran, welche als die Hauptursache für die beobachtete Inaktivierung identifiziert werden kann. Letztlich wurde die Eignung der Hochdruckvorbehandlung zur Verbesserung der Hitzestabilität von L. rhamnosus GG überprüft. Perspektivisch ließe sich diese Art von Vorbehandlung einsetzen, um die probiotischen Keime mit Hilfe ihrer induzierbaren Abwehrmechanismen gegenüber der Hitze- und Dehydrationsstress bei der Sprühtrocknung resistenter zu machen. Es zeigte sich, dass durch Druckvorbehandlung die Keime kurzzeitig gegenüber letaler Hitze resistenter waren. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass offensichtlich die als Reaktion auf die Druckvorbehandlung synthetisierten Stressproteine an der erhöhten Hitzeresistenz beteiligt sind. Anhand durchflusszytometrischer Analyse war es ersichtlich, dass diese Metaboliten die bakteriellen Membranen einen erhöhten Schutz vor hitzebedingter Schädigung verliehen.
This work deals primarily with the evaluation of the applicability of spray drying as an alternative method for the production of probiotic powder. Optimal drying conditions were determined and the protective media were characterized in terms of their thermophysical properties and capability of direct interaction with a synthetic membrane system. Spray drying at temperature of 80 °C allowed production of probiotic powder on skim milk basis with a residual moisture of 4% and a bacterial load of 109 cells per g. The selection of the carrier medium is regarded crucial, since this medium determines the survival behavior during the storage, which in turn affects the quality criteria of the probiotic products as well as the declared health-promoting effect. Partial exchange of the skim milk solids with commercial prebiotic compounds did not have any detrimental effect upon spray drying. However, the inactivation of spray dried Lactobacillus rhamnosus GG during storage at 37°C was more pronounced when the bacteria were dried in prebiotic preparations compared to the ones dried in skim milk. Furthermore it was found that the formation of a glassy state contributed only little to the maintenance of storage stability. The different protective effect of the drying media applied was thought to be governed by the spatial and/or chemical structure of the protective compounds, which could facilitate a direct interaction with cell membranes and/or their components. This view was confirmed by further work regarding the drying of model phospholipid bilayers, i.e. liposomes in the presence of different types of sugar molecules. The influence of milk proteins was examined to further clarify the outstanding protection of bacteria dried in skim milk. It was shown that probiotic bacteria dried in proteolytically treated skim milk were inactivated faster than the one dried in native skim milk during storage. Furthermore, work on flow cytometric analysis was conducted in order to allow the characterization of cell damage during spray drying. This required appropriate staining and measurement strategy, which had to be established first. Initially, this method was applied to characterize cellular damage as affected by different physical treatments, including high pressure, heat, or ultrasound. It was shown that during heat treatment beyond 60°C the loss of the membrane integrity could be identified as the primary cause of heat-induced cell death. In contrast, the irreversible damage of the membrane-bound enzyme systems was responsible for high pressure-induced cell death. Compared to the heat-killed cells the population of the pressure-inactivated cells consisted mainly of cells, which still had intact membranes. With help of flow cytometric analysis it was demonstrated that upon spray drying, the higher level of inactivation of L. rhamnosus GG at higher temperatures was closely related to increased damage in the cell membrane. The application of sub-lethal high pressure pretreatment was examined in terms of evaluating possible approaches for the improvement of heat stability of L rhamnosus GG. The rationale of applying this pretreatment is to take advantage of the inducible defense mechanisms of the organisms to make them more resistant against stresses related to spray drying, i.e. stress due to thermal exposure and dehydration. It was shown that pressure pretreated bacteria showed higher thermotolerance as compared to unadapted ones. Furthermore, it was found that apparently the stress proteins synthesized as response to the pressure pretreatment are involved in the increased heat tolerance. On the basis of flow cytometric analysis it was demonstrated that these proteins may have a protective effect on the bacteria membranes, which led to an increased protection against heat-induced damage.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-11196
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1515
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1218
Exam Date: 29-Apr-2005
Issue Date: 27-Oct-2005
Date Available: 27-Oct-2005
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Durchflusszytometrie
Hochdruck
Probiotika
Sprühtrocknung
Stresstoleranz
Flow cytometry
High pressure
Probiotics
Spray drying
Stress tolerance
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