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Main Title: Structure analysis of DNA relaxases, the key enzymes of bacterial conjugation: TraA and its N-terminal relaxase domain of the Gram-positive plasmid pIP501 show specific oriT binding and behave as dimers in solution
Translated Title: Strukturanalyse von DNA-Relaxasen, den Schlüsselenzymen der bakteriellen Konjugation: TraA und die N-terminale Relaxase Domäne aus Gram-positiven Plasmid pIP501 zeigen spezifische Bindung an oriT und bilden Dimere in Lösung
Author(s): Kopec, Jolanta
Advisor(s): Grohmann, Elisabeth
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Die DNA Relaxase TraA ist auf dem konjugativen Plasmid pIP501, das einen breiten Wirtsbereich aufweist, kodiert. Es ist die zweite charakterisierte Relaxase, die aus einem Gram positiven Organismus stammt, nach MobMpMV158. TraA (654 Aminosäuren) und die N-terminale Domäne (Aminosäuren 1-246), bezeichnet als TraAN246, wurden als His-tag Fusionsproteine exprimiert und gereinigt. Kleinwinkelröntgenstreuung und chemische Quervernetzung bewiesen, dass TraA und TraAN246 Dimere in Lösung bilden. Beide Proteine zeigten in vitro oriTpIP501 Spaltungsaktivität für Superhelix DNA. oriT Bindung der Relaxase wurde mittels Gel Retardations Assay nachgewiesen. Radioaktiv markierte Oligonukleotide, die verschiedene Teile von oriTpIP501 umfassten, wurden zur Bindung mit TraA und TraAN246 eingesetzt. Das längste Target Oligonukleotid enthält eine Haarnadelstruktur, die Nickstelle und 7 weitere Nukleotide. Die Dissoziationskonstante des Protein-DNA Komplexes beträgt 55 nM für TraA und 26 nM für TraAN246. Die Entfaltung von beiden Proteinkonstrukten wurde mittels Zirkulärem Dichroismus (CD) analysiert. Die Schmelztemperatur (TM), detektiert durch Signaländerung bei 220 nm, wurde für beide Proteine als 42°C bestimmt. Die CD Spektren, gemessen bei 20°C, zeigten für TraA 30 % -helikale und 13 % -Faltblatt Strukturen und für das verkürzte Protein 27 % -helikale und 18 % - Faltblatt Strukturen. Die Tatsache, dass die DNA Bindung Sekundärstrukturgehalt und thermische Stabilität von TraAN246 erhöht, weist auf einen induzierten Fit Mechanismus für die Entstehung von spezifischen Relaxase-oriT Komplexen hin. Beide Proteine binden die Promotor Region des tra Operons und regulieren dadurch seine Transkription. Weiters wurde im Rahmen dieser Arbeit die von pIP501 kodierte lytische Transglykosylase (LT) Orf7 untersucht. Die Expression und Reinigung von löslichem Orf7 Protein aus E. coli wurde etabliert. 3D Strukturmodelle wurden für Orf10pIP501 und die LT Domäne von Orf7 berechnet. Diese Modelle können als Suchmodelle zur Lösung der Kristallstruktur mittels der molekularen Ersatzmethode (molecular replacement) benutzt werden.
TraA is the DNA relaxase encoded by the broad-host-range Gram-positive plasmid pIP501. It is the second relaxase characterized from plasmids originating from Gram-positive organisms. TraA (654 amino acids) and the N-terminal domain (246 amino acids), termed TraAN246, were expressed as 6×His-tagged fusions and purified. Small-angle X-ray scattering and chemical cross-linking proved that TraAN246 and TraA form dimers in solution. Both proteins revealed oriTpIP501 cleavage activity on supercoiled plasmid DNA in vitro. oriT binding was demonstrated by electrophoretic mobility shift assays. Radiolabeled oligonucleotides covering different parts of oriTpIP501 were subjected to binding with TraA and TraAN246. The KD of the protein-DNA complex encompassing the inverted repeat (IR), the nick site and additional 7 bases, was found to be 55 nM for TraA, and 26 nM for TraAN246. The unfolding of both protein constructs was monitored by measuring the change in the circular dichroism (CD) signal at 220 nm upon temperature change. The unfolding transition of both proteins occurred at around 42°C. CD spectra measured at 20°C showed 30 % α-helix and 13 % β-sheet for TraA and 27 % α-helix and 18 % β-sheet content for the truncated protein. Upon DNA binding an enhanced secondary structure content and increased thermal stability was observed for the TraAN246 protein suggesting an induced-fit mechanism for the formation of the specific relaxase-oriT complex. Both proteins bind to promoter region of tra operon and therefore regulate its transcription. Expression of soluble Orf7 protein was achieved, the protein turned out to possess lytic transglycosylase (LT) activity. 3D structure models were calculated for Orf10 and LT domain of Orf7. These models can be used as search models in crystal structure solution by molecular replacement method.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-13754
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1731
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1434
Exam Date: 13-Jul-2006
Issue Date: 22-Sep-2006
Date Available: 22-Sep-2006
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Aggregationszustand
DNA-Protein Interaktion
Plasmid pIP501
Relaxase
Zirkular Dichroismus
Aggregation state
Circular dichroism
DNA–protein interaction
Plasmid pIP501
Relaxase
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