Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1612
Main Title: Natürliche Kombinatorik in der Biosynthese der Ergotalkaloide vom Peptidtyp im Mutterkornpilz Claviceps purpurea
Translated Title: Natural combinatorics in the biosynthesis of ergotpeptides in the ergot fungus Claviceps purpurea
Author(s): Ortel, Ingo
Advisor(s): Keller, Ullrich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Ziel der vorliegenden Arbeit war die Aufklärung der Biosynthese des Ergometrins und der Funktion bestimmter Gene des Ergotalkaloid Biosynthesegenclusters im Mutterkornpilz Claviceps purpurea. Nachdem in früheren Arbeiten gezeigt werden konnte, dass die Biosynthese der D-Lysergyltripeptide des Ergopeptintyps an zwei nichtribosomalen Peptidsynthetasen LPS1 und LPS2 verläuft, wurde in dieser Arbeit die Beteiligung des Gens cpps2 aus dem Ergotalkaloid Biosynthesegencluster als Gen des D-Lysergsäuremoduls LPS2 bestätigt. Es konnte an einer Disruptionsmutante des cpps2-Gens gezeigt werden, dass die Ausschaltung dieses Gens zum Verlust der Ergopeptinsynthese bei gleichzeitiger Akkumulation von D-Lysergsäure führt. Die Expression von cpps2 in E. coli resultierte in einem 144 kDa Fusionsprotein, dass partiell in löslicher Form erhalten werden konnte und nach Aufreinigung den D-Lysergsäure-abhängigen ATP-PPi-Austausch katalysierte. Des weiteren konnte diese rekombinante LPS2 mit der Phosphopantetheintransferase SFP und CoenzymA so modifiziert werden, dass es die Bildung des Enzymthioesters mit radioaktiver Dihydrolysergsäure katalysierte. Dies ist das erste Beispiel für die posttranslationale Modifikation einer pilzlichen NRPS mit SFP. Das System der Ergometrinsynthese wurde zellfrei dargestellt und charakterisiert. Es benötigt D-Lysergsäure, Alanin und NADPH unter Verbrauch von ATP. Enzymatisch gebildetes Ergometrin wurde durch radiochemische Analyse und chromatographischen Vergleich mit authentischem Referenzmaterial identifiziert. Die kinetischen Parameter der Reaktion wurden mit Km = 125 µM für Alanin und 8 µM für NADPH bestimmt. Kcat liegt bei 1 2 min-1, im Vergleich zu 1 min-1 für die D-Lysergyltripeptidsynthese. Die Auftrennung des Ergometrin-Bioynthesesystems in seine Enzymkomponenten ergab, dass es sich um zwei Enzyme handelt. Komplementationsstudien zeigten, dass die D-Lysergsäure-aktivierende Komponente identisch mit der LPS2 des Ergopeptin-Biosynthesesystems ist. Die Reaktion verläuft über enzymgebundenes D-Lysergylalanin, wobei sämtliche zur Ergometrinsynthese notwendigen Funktionen auf einer Polypeptidkette, die als LPS3 bezeichnet wurde, liegen. Aufgrund der Domänenanordnung war das Gen cpps3 des Ergotalkaloid Biosynthesegenclusters als codierendes Gen der LPS3 angenommen worden, da es für ein Protein mit A-Domäne, T-Domäne, Red-Domäne und einer möglicherweise kryptischen C-Domäne kodiert. Antikörper, die gegen die Reduktasedomäne des cpps3-codierten Enzyms erzeugt worden waren, führten in Western-Blot Analysen von Ergometrinsynthetase enthaltenden Fraktionen tatsächlich zur Identifizierung einer Bande der Masse von 200 kDa an. Analyse der Sequenz des cpps3- codierten Enzyms ergab eine hohe Übereinstimmung mit der beobachteten Größe der LPS3. Die Daten zeigen eindeutig, dass die D-Lysergsäurepeptide im Mutterkornpilz Claviceps purpurea von aus Untereinheiten zusammengesetzten Systemen synthetisiert werden, die LPS2 als gemeinsames Initiationsmodul verwenden. Dieser neue Typ von pilzlichen Peptidsynthetasen katalysiert die Synthese ihrer Peptidprodukte in einer natürlichen Kombinatorik von Synthetasemodulen. Die abschließende biochemische Untersuchung einer Disruptionsmutante des cpP450-Gens aus dem Ergotalkaloid Biosynthesegencluster führte zur Charakterisierung von CLOA. Dieses Enzym katalysiert die oxidative Umsetzung des Clavinalkaloids Elymoclavin zu Paspalsäure, der unmittelbaren D-Lysergsäurevorstufe, aber nicht die Umsetzung von Agroclavin zu Elymoclavin. CLOA ist somit eines der Schlüsselenzyme der D-Lysergsäurebiosynthese und stellt das funktionelle Bindeglied zwischen der Clavin- und der D-Lysergsäurealkaloid-Biosynthese dar.
The aim of this thesis was the investigation of the biosynthesis of ergometrine in the ergot fungus Claviceps purpurea and the study of gene-functions in the ergot alkaloid biosynthesis gene cluster. The synthesis of ergopeptines is catalysed by the two D-lysergyl peptide synthetases LPS1 and LPS2 in a nonribosomal mechanism. In this work it could be shown, that gene cpps2 encodes the D-lysergic acid activating enzyme LPS2. Disruption of cpps2 in Claviceps purpurea causes loss of ergopeptine synthesis, whereas D-lysergic acid is accumulated. Heterologous expression of LPS2 in E. coli results in the formation of a soluble 144 kDa fusion protein, which catalysed the D-lysergic acid dependent ATP-PPi-exchange reaction. Moreover, after incubation of the rekombinant protein with the phosphopantetheinyl transferase SFP and coenzymeA, the enzyme catalysed the ATP-dependent formation of an enzyme thioester with D-lysergic acid. Analysis and characterisation of the ergometrine biosynthesis system was performed in a cell-free synthesis system. The ergometrine synthetase catalyses the formation of ergometrine from alanine and D-lysergic acid in an ATP- and NADPH-dependent reaction. The kinetical parameters of this reaction could be determined. The Km value for alanine is 125 µM and for NADPH 8 µM; kcat is 1-2 min-1. Separation of enzymes responsible for ergometrine biosynthesis revealed, that the ergometrine biosynthesis system consists of two distinct modules. Complementation studies showed, that in this reaction the D-lysergic acid activating enzyme is identical with LPS2 of the ergopeptine synthesis system. The ergometrine synthetase contains all functions necessary for the formation of ergometrine. It exclusively activates alanine which is transfered to the D-lysergic acid moiety leading to D-lysergyl alanine as covalently bound peptide intermediate. Western blot analysis with antibodies against the reductase domain of the encoded cpps3 gene product led to identification of a protein of a molecular weight of 200 kDa in the ergometrine containing protein fractions. This value correlates with the theoretical Mw of the predicted cpps3-encoded protein. These data clearly indicate, that the D-lysergic acid peptides in the ergot fungus Claviceps purpurea are synthesised by distinct combinatorial systems using the D-lysergic acid activating enzyme LPS2 as common and central initiation module. Furthermore, the biochemical investigation of a disruption mutant of the cpP450 gene of the ergot alkaloid biosynthesis gene cluster led to the characterisation of CLOA. This enzyme is responsible for hydroxylation of elymoclavine to paspalic acid, the direct precursor of D-lysergic acid. Therefore, CLOA could be described as an enzyme catalysing a critical step in the biosynthesis of D-lysergic acid, bridging the synthesis of clavines and ergopeptines.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-15720
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1909
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1612
Exam Date: 22-May-2007
Issue Date: 8-Jun-2007
Date Available: 8-Jun-2007
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Ergometrin
Ergotalkaloide
Mutterkornpilz
NRPS
Peptidbiosynthese
Ergometrine
Ergot fungus
Ergotalkaloids
NRPS
Peptide biosynthesis
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