Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1665
Main Title: Molekularbiologische Feintypisierung von Yersinia spp.- Stämmen aus Mastgeflügel
Translated Title: Molecular biological Fingerprinting of Yersinia spp. - Strains from Broilers
Author(s): Toutounian-Mashhad, Kaveh
Advisor(s): Stahl, Ulf
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden aus einem experimentellen Infektionsversuch von Mastgeflügel insgesamt 747 verdächtige Yersinia spp.- Stämme aus 15 Durchgänge (A – O) nicht nur biochemisch sondern auch mittels PCR- Verfahren spezifiziert. Hierbei wurde das Genus (Yersinien), die Spezies (Yersinia enterocolitica) und die Pathogenität (yopT- Gen) der Feldstämme mittels Multiplex- PCR- Verfahren ermittelt. Die PCR- Ergebnisse zeigten, dass 596 (79,8%) Isolate als Yersinia- negativ, 130 (17,4%) Isolate als Y. enterocolitica (yopT+) und 21 (2,8%) Isolate als Yersinia enterocolitica (yopT-) anzusehen waren. Die meiste Yersinia enterocolitica- positive Stämme wurden 2. bis 10. Tag post infectionem gefunden. Ab dem 12. Tag post infectionem wurden keine Yersinia spp.- Stämme identifiziert. Insgesamt wurden 130 Yersinia spp.- Isolate (yopT+) und 21 Isolate (yopT-) für die Feintypisierung mittels PFGE- und AFLP- Methode ausgewählt. Als Referenzstamm wurden wie bei der PCR- Methode die Yersinia enterocolitica DSM 13030 (4/O:3) benutzt. Zusätzlich wurden drei Yersinia enterocolitica- Stämme unterschiedlicher Bioserotypen (4/O:3 yopT- negativ; O:5,27; 1A/O:7,8) und Yersinia pseudotuberculosis (ATCC 29833) mitgeführt um die genotypische Unterschiede zwischen den Referenzstämmen und innerhalb der Spezies Yersinia enterocolitica zu untersuchen. Die Ergebnisse der PFGE- und AFLP- Typisierung von Referenzstämmen zeigten, dass es mittels beider Methoden möglich war, innerhalb der Spezies Yersinia enterocolitica die Bioserotypen voneinander zu unterscheiden. Hierbei konnte festgestellt werden, dass das Profil der Bandenmuster von Yersinia enterocolitica- Stämmen des Bioserovars 4/O:3 sich zu 83,3 bis 87% ähnelte. Alle Yersinia spp.- Stämme, die in verschiedenen Versuchstagen nach der Infektion isoliert wurden, wiesen eine enge genetische Verwandtschaft zum Yersinia enterocolitica (DSM 13030)- Stamm auf und wurden aus diesem Grund als ein Genotyp bezeichnet. Die Bandenmuster- Ähnlichkeit der Yersinia spp.- Stämme betrug bei der PFGE- Methode (91,7 – 100%) und bei AFLP- Methode (90,1 – 99,8%). Die PFGE- und AFLP- Untersuchungen zeigten, dass der im Tierversuch eingesetzte Yersinia enterocolitica DSM 13030- Stamm in allen Isolaten, die mittels PCR bestätigt wurden, wieder zu finden war. Mit den beiden Methoden wurden genetische Fingerabdrücke der Isolate hergestellt, die sich in ihrer diskriminierenden Aussagekraft unterschieden. Beide Typisierungsmethoden basierten auf die Darstellung von Teilen (Fragmenten) des gesamten Genoms. Für den Vergleich der Bandenmuster wurden bei beiden Methoden die cut- off- Werte der Auswertungs- Software bei 90% festgelegt. Alle Isolate die eine Ähnlichkeit von mehr als 90% zeigten, wurden als genetisch eng miteinander verwandt bezeichnet (klonal). Der Vergleich der beiden Methoden miteinander zeigte, dass die AFLP- Methode aufgrund höherer Diskriminierungsstärke, ihrem geringen zeitlichen Aufwand, ihrer sehr guten Reproduzierbarkeit und besseren Handhabung eine hervorragende Methode für die Genotypisierung von Yersinia spp.- Stämmen darstellt.
In the context of the presented work from an experimental infection attempt of broiler chickens altogether 747 suspicious Yersinia spp. strains from 15 passages (A to O) were specified not only biochemically but also by PCR procedure. The Genus (Yersinia), the species (Yersinia enterocolitica) and the pathogenicity (yopT gene) of the field strains were identified using multiplex PCR procedure. The PCR results showed that 596 (79.8%) isolates were Yersinia- negative, 130 (17.4%) isolates were Y. enterocolitica (yopT+) and 21 (2.8%) were Yersinia enterocolitica (yopT-). Most of the Y. enterocolitica positive strains were found in the 2nd to 10th day post infection. Starting from 12th day post infection no Yersinia spp. - strains were identified. Altogether 130 Yersinia enterocolitica isolates (yopT+) and 21 Yersinia enterocolitica isolates (yopT-) were selected for genotyping using PFGE and AFLP methods. As reference strains (as with the PCR method) Yersinia enterocolitica DSM 13030 (4/O: 3) were used. In addition, three Yersinia enterocolitica strains of different bioserotyps (4/O:3 yopT negative; O:5,27; 1A/O:7,8) and Yersinia pseudotuberculosis (ATCC 29833) were included to examined the genotype differences between the reference strains and the species Yersinia enterocolitica. The results of the PFGE and AFLP typing of reference strains showed that it was possible using both methods to differentiate bioserotyps within the species Yersinia enterocolitica from each other. On this occasion it could be registered that the profiles of band patterns of Yersinia enterocolitica bioserotyp 4/O: 3 demonstrated 83.3% to 87% similarity. All Yersinia spp. strains, which were isolated at different days after the infection, revealed a close genetic relationship to Yersinia enterocolitica DSM 13030 and for this reason were characterized as one genotype. The band pattern similarity of the Yersinia spp. strains amounted to 91.7 - 100% using the PFGE method and 90.1 - 99.8% using the AFLP method. The PFGE and AFLP investigations showed that the Yersinia enterocolitica DSM 13030 - strain used in the bioassays was regainable. That was confirmed by using PCR. The two genotyping methods used differed in their discriminating power. Both genotyping methods were based on the detection of parts (fragments) of the entire gene. During the comparison of the band patterns with both methods the cut-off value of the analysis software was specified with 90%. All isolates which showed a similarity of >90%, were described as genetically closely related (clone). The comparison of the two methods showed that the AFLP method, due to higher discrimination strength, their small temporal expenditure, their very good reproducibility and better handling proofed to be a very good method for the genotyping of Yersinia spp. strains.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-16284
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/1962
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1665
Exam Date: 10-Jul-2007
Issue Date: 28-Aug-2007
Date Available: 28-Aug-2007
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): AFLP
Clusteranalyse
Genotypisierung
PCR
PFGE
AFLP
Cluster analysis
Genotyping
PCR
PFGE
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