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Main Title: Pathogen – Wirtszellinteraktion. - Untersuchung der Rolle des Typ III Effektorproteins Tarp für die Invasion von Chlamydia trachomatis
Translated Title: Pathogen – host cell interaction. - The role of the type III effector protein Tarp for the invasion of Chlamydia trachomatis
Author(s): Mehlitz, Adrian
Advisor(s): Stahl, Ulf
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Chlamydia trachomatis, ein wichtiges humanpathogenes Bakterium, sekretiert während der Invasion in seine Wirtszelle das Typ III Effektorprotein Tarp. In silico Analysen offenbarten eine Homologie zwischen Tarp und Src-Kinasesubstraten. Diese Analyse ließ sich unter Verwendung verschiedener biochemischer Methoden bestätigen. So zeigte sich, dass sich die Tarp Tyrosinphosphorylierung durch einen Src-spezifischen Inhibitor blockieren lässt und dass Tarp durch rekombinantes Src in vitro phosphoryliert wird. In vivo konnte bestätigt werden, dass Tarp nicht in src-, fyn- und yes-defizienten Zellen phosphoryliert wird. Inhibiert man die Src-Kinasen während der Invasion, so führt dies zu einer um 60% abgeschwächten Chlamydieninfektion. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Interaktion von phosphoryliertem Tarp mit zellulären Komponenten untersucht. Experimente mit SH2-Domänenarrays haben eine Interaktion mit PLCγ, Shc, Lck und Shp-2 gezeigt. Die Interaktion zwischen Tarp und PLCγ, bzw. Tarp und Shc ließ sich mittels Immunpräzipitation bestätigen, eine morphologische Charakterisierung mittels Immunfluoreszenz im Anschluss zeigte, dass PLCγ mit den Bakterien während der Invasion kolokalisiert. Inhibiert man PLCγ während der Invasion verhindert dies die Inklusionsbildung der C. trachomatis-Infektion nahezu vollständig. Eine Inhibition nach der Invasion hingegen hatte nur einen sehr geringen Einfluss auf die Infektion. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde untersucht, welche Bedeutung die Rekrutierung von PLCγ für den Invasionsprozess hat. Mit Hilfe konfokaler Echtzeitmikroskopie wurde der Phosphoinositolmetabolismus untersucht und es zeigte sich, dass Chlamydien eine PtdIns(3,4,5)-P3-angereicherte frühe Inklusion bilden. Biochemische Experimente ließen erkennen, dass die Bildung dieser frühen Inklusion PI3K- und PLCγ- abhängig ist, und dass die Inhibition dieser Enzyme zur lysosomalen Degradation der Bakterien führt. Die Bildung einer PtdIns(3,4,5)-P3-angereicherten frühen Inklusion stellt demnach einen bisher unbekannten bakteriellen Mechanismus zur Vermeidung der Degradation dar.
Chlamydia trachomatis is an important pathogenic bacterium. Tarp, a type III effector protein, is secreted into the human host cell during invasion. In silico analysis revealed homology between Tarp and Src kinase substrates. This initial observation was confirmed using different biochemical methods. Inhibition with Src specific inhibitors blocks Tarp tyrosine phosphorylation and Tarp can be phosphorylated using recombinant Src. Using cells deficient in src, yes and fyn it was shown that Tarp phosphorylation is controlled by Src kinases in vivo. Inhibition of Src kinases during invasion leads to a 60 % reduced primary infection. The second part of this work deals with the interaction between phosphorylated Tarp and host cell components. Experiments using SH2-domain arrays show an interaction with PLCγ, Shc, Lck and Shp-2. The interaction between Tarp, PLCγ and Shc was confirmed using immunoprecipitation. A morphological characterization via immunofluorescence confirmed colocalisation between invading bacteria and PLCγ. Inhibition of PLCγ during invasion abrogates inclusion formation while this is not the case when PLCγ is inhibited at a later stage. The last part of this thesis deals with the question how PLCγ influences the invasion of Chlamydia trachomatis. Using live cell confocal microscopy the host phosphoinositide metabolism during infection was investigated. It was shown that Chlamydia induces strong PtdIns(3,4,5)-P3 formation and that the endosome surrounding the organism is enriched with this rare phospholipid. Biochemical experiments showed that the endosome formation is PI3K and PLCγ dependant and inhibition of these enzymes leads to lysosomal degradation of the bacteria. Thus, formation of the PtdIns(3,4,5)-P3 enriched early inclusion is a so far unknown bacterial mechanism to avoid lysosmal degradation within the host cell.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-17028
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2020
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1723
Exam Date: 20-Nov-2007
Issue Date: 14-Dec-2007
Date Available: 14-Dec-2007
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Chlamydia
Invasion
Tarp
Chlamydia
Invasion
Tarp
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