Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1804
Main Title: Produktion und Freisetzung von L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) mit genetisch modifizierten Stämmen von Saccharomyces cerevisiae
Translated Title: Production and release of sn-glycerol 3-phosphate (L-G3P) with engineered strains of Saccharomyces cerevisiae
Author(s): Popp, Almut
Advisor(s): Stahl, Ulf
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: L-G3P ist ein intrazelluläres phosphoryliertes Stoffwechselzwischenprodukt und zählte als solches bisher nicht zur Produktpalette von Hefe-Fermentationen. Um L-G3P als Baustein für die enzymatische Synthese von Monosacchariden und für andere Anwendungen zu gewinnen, wurden Bedingungen gesucht, unter denen ein S. cerevisiae-Produktionsstamm mit ausgeschalteter Glycerol-3-Phosphatase (gpp1/2) und Überexpression der cytosolischen Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase (GPD1) gleichzeitig gute L-G3P-Produktion und akzeptable Biomasseproduktion zeigt. In einer Zwei-Phasen-Fed-Batch-Fermentation von Glucose, bei der auf eine aerobe Phase mit respirofermentativem Stoffwechsel und Biomasseproduktion von rund 14 g/l eine strikt anaerobe Phase mit fermentativem Stoffwechsel und nahezu ohne Wachstum folgte, wurde ein maximaler Produkttiter von 325 mg/l erreicht, was dem 25-fachen der Ausgangssituation entspricht. Der Vergleich zweier Fermentationen mit unterschiedlichem Belüftungsprofil (Zwei-Phasen-Fermentation aerob/anaerob und microaerobe Fermentation) erbrachte außerdem als relevante phänotypische Eigenschaften des Produktionsstammes eine teilweise wachstumsgekoppelte L-G3P-Produktion und die sauerstoffabhängige Ausprägung von Maxima des intrazellulären L-G3P-Spiegels. Die Abnahme von intrazellulärem L-G3P nach dem Erreichen der Maxima beruhte auf mindestens zwei unerwarteten Phänomenen: der Produktion erheblicher Mengen des Nebenproduktes Glycerol und der Freisetzung von L-G3P aus lebenden Zellen in den Kulturüberstand. Zum Phänotyp des Produktionsstammes gehörte außerdem eine ausgeprägte Ethanolsensitivität, die das Wachstum bei relativ niedrigen Zelldichten begrenzte. Da die Degradation von L-G3P anscheinend intrazellulär erfolgte, ist eine schnellere spezifische Freisetzung von L-G3P aus den Zellen wünschenswert. Daher wurde der sekundäraktive L-G3P-Transporter GlpT aus Escherichia coli im S. cerevisiae-Produktionsstamm überexprimiert und konnte in der membrangebundenen Fraktion der Proteine nachgewiesen werden. Der bakterielle Transporter trat in den sekretorischen Weg der Hefezellen ein, indem er wahrscheinlich cotranslational in die ER-Membran integrierte, er wurde nicht glykosyliert. Überexpression von GlpT führte dennoch nicht zur verstärkten Ausscheidung von L-G3P aus dem Produktionsstamm. Grund dafür war die Misslokalisierung des Transporters, der zum größten Teil im ER festgehalten wurde und die Plasmamembran nicht erreichte. Dies wurde mit Immunfluoreszenz-Mikroskopie gezeigt. Die Fusion von N-terminalen Sequenzen des Hefe-Plasmamembranproteins Ste2p an GlpT verbesserte die Lokalisierung nicht. Da zelluläre Qualitätskontrollsysteme des ER, des Golgi-Apparats und der Plasmamembran bei der Degradation in der Vakuole konvergieren, gibt die Abhängigkeit der Expressionsstärke von GlpT von der vakuolären Proteinase A (Pep4p) keine Auskunft darüber, welche dieser Systeme GlpT angreifen.
L-G3P is a phosphorylated intracellular metabolite. It can be used as a building block in the enzymatic synthesis of diverse monosaccharides and their derivatives. Production of this class of metabolites with yeast fermentations is still a challenging task. The intracellular accumulation of the product leads to poor cell growth and a low product-to-biomass ratio. A Saccharomyces cerevisiae strain which accumulates L-G3P because it was engineered in G3P formation (overexpression of GPD1) and degradation (deletion of gpp1/2) was used. In order to produce acceptable amounts of biomass with this strain, suitable fermentation conditions were tested. A two-phase fermentation was set up with the following parameters: production of 14 g/l biomass as yeast dry weight during the aerobic phase with respirofermentative metabolism, and production of 325 mg/l L-G3P during the fastidious anaerobic phase with fermentative metabolism. Cell growth was restricted to the aerobic phase. The achieved product titre was 25 times that of earlier reports. Comparison of the two-phase fermentation with a microaerobic fermentation led to enhanced knowledge on the engineered strain’s performance. L-G3P production within this strain was coupled to growth under some conditions, and the intracellular L-G3P itself was not stable, but decreased after reaching a maximum, when oxygen was available. Decrease of the intracellular L-G3P level was due to two unexpected phenomena: the production of glycerol in spite of the deletion of the specific glycerol 3-phosphatase and the release of L-G3P into the culture supernatant in spite of the metabolite’s phosphorylation. The strain also showed unusual sensitivity to ethanol, which limits growth. As the degradation of L-G3P to glycerol obviously occurred intracellularly, a more effective release of the desired product into the supernatant would relieve the problem. Therefore, the specific secondary active L-G3P transporter GlpT from Escherichia coli was overexpressed in the L-G3P accumulating yeast strain. The transporter was found within the membrane fraction of yeast protein. It entered the yeast secretory pathway through integration into the endoplasmic reticulum (ER) membrane and was not glycosylated. Overexpression of the transporter, however, did not improve the release of L-G3P from the yeast cells because the transporter was trapped in endomembranes and did not reach the plasma membrane. This was shown with immunofluorescence microscopy. The fusion of N-terminal sequences of the yeast alpha factor receptor (Ste2p) to the bacterial membrane protein did not improve its localisation in yeast. The expression level of GlpT was shown to be proteinase A (Pep4p)-dependent. This does not allow any conclusion regarding a degradation pathway to be drawn, as both ER and post-ER quality control pathways converge in the vacuole.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-17762
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2101
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1804
Exam Date: 13-Jul-2007
Issue Date: 12-Mar-2008
Date Available: 12-Mar-2008
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Fermentation
Glycerol-3-Phosphat
Hefe
Metabolic engineering
Saccharomyces cerevisiae
Fermentation
Glycerol 3-phosphate
Metabolic engineering
Saccharomyces cerevisiae
Yeast
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