Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1826
Main Title: Charakterisierung und Identifizierung epigenetischer Brustkrebsbiomarker
Translated Title: Characterization and Identification of Epigenetic Breast Cancer Biomarkers
Author(s): Dietrich, Dimo
Advisor(s): Görisch, Helmut
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Biomarker, die eine Diagnose der Brustkrebserkrankung zu einem frühen Stadium ermöglichen, die eine Prognose des Ausgangs der Erkrankung oder die das Ansprechen auf eine bestimmte Behandlung erlauben, sind für die Verbesserung des Managements der Erkrankung von großem klinischen Interesse. DNA Methylierung spielt eine wesentliche Rolle bei der Karzinogenese und stellt damit eine wertvolle Quelle für Brustkrebsbiomarker dar. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung bekannter Methylierungsbiomarker, wie der prognostischen Biomarker TFF1, PITX2 und uPA und der diagnostischen Biomarker RASSF1A, LIMK1, SLIT2, SLITRK1 und HS3ST2. Zusätzlich wurden Kandidatengene analysiert, um neue Biomarker zu identifizieren. Das PITX2 Gen kodiert für drei Transkripte: PITX2 A, B and C. Die Isoform C wird durch einen alternativen Promotor reguliert. Eine Analyse von Brustkrebszelllinien zeigte eine Korrelation der Methylierung der Promotorregionen mit der Expression der entsprechenden Transkripte. Es konnte gezeigt werden, dass Promotormethylierung der Transkriptvarianten A und B ein stärkerer prognostischer Biomarker verglichen mit der Promotormethylierung der Variante C ist. Die Analyse von Tumoren von 384 Brustkrebspatientinnen im Rahmen einer DNA Mikroarraystudie führte zu der Identifizierung von BMP4, NR5A1, BARX1 und FGF4 als Methylierungsbiomarker, welche eine Vorhersage des Ausgangs der Krankheit bei Lymphknoten-positiven, Steroidhormonrezeptor-positiven Brustkrebspatientinnen erlaubt, die eine adjuvante Anthrazyklin-basierte Chemotherapie erhalten haben. Bis heute ist nicht klar, wie die verschiedenen Komponenten des Tumors zu der gemessenen Methylierung beitragen. Die Lasermikrodissektion ist eine Technologie, die die Isolierung bestimmter Zellen ermöglicht aber nicht genügend Material für die meisten Standardmethoden zur Methylierungsmessung liefert. Eine zusätzliche Herausforderung tritt bei Proben von Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Geweben auf, welche nur fragmentierte DNA niedriger Qualität enthält. Deshalb wurde eine Methode zur simultanen Analyse mehrerer Gene bei einer limitierten Anzahl von dissezierten Zellen aus Formalin-fixierten und Paraffin-eingebetteten Geweben entwickelt. Diese Methode umfasst: 1. ein optimiertes, für die Konversion von DNA aus einigen wenigen Zellen geeignetes, Bisulfitbehandlungsprotokoll, 2. sequentielle PCR Amplifikationen und 3. eine neue Methode zur quantitativen Bisulfitsequenzierung basierend auf der Einführung eines Normalisierungssignals in das PCR Produkt. Diese Methode wurde verwendet, um die Methylierung der Gene PITX2, RASSF1A, uPA, LHX3, PITX3, LIMK1, SLITRK1, SLIT2, HS3ST2 und TFF1 bei drei ausgewählten, invasiven duktalen Brustkrebsfällen zu analysieren. Mikrodissezierte Proben wurden von intraduktalem und invasivem Karzinom, Stroma, Tumor-infiltrierenden Lymphozyten, Fettgewebe, Brustwandmuskel, Adenose und normalem Drüsenepithel gewonnen. Alle analysierten Gene zeigten Hypermethylierung in invasiven und intraduktalen Krebszellen verglichen mit den anderen Gewebekomponenten, mit Ausnahme von TFF1, welches eine umgekehrte Methylierung aufwies. Einige Gene zeigten geringe Methylierung im normalen anliegenden Brustgewebe und in Tumor-infiltrierenden Lymphozyten. Die Methylierung variierte wenig innerhalb eines Gewebetypes und zwischen verschiedenen Paraffinblöcken eines Brustkrebsfalls. Die entwickelte Methode ist ein leistungsstarkes Werkzeug für die Methylierungsanalyse von multiplen Markern in verschiedenen mikrodissezierten Gewebekomponenten und kann hilfreich für die Analyse der verschiedenen Übergangsstadien von Brust und anderen Krebsformen sein. Diese Methode ist außerdem für viele Anwendungen neben der Analyse mikrodissezierter Zellen geeignet, wie z.B. Methylierungsanalyse mehrerer Gene in Körperflüssigkeiten (Serum, Plasma, Urin), Spülflüssigkeiten, disseminierten Tumorzellen, embryonalen Zellen, isolierten Stammzellen, etc.
Biomarkers that enable the diagnosis of breast cancer at an early state, which allow for a prognosis of the outcome of the disease, and which are suitable for predicting the response to a certain treatment are highly desired for clinical use to improve patient management. DNA methylation has been shown to play a major role in carcinogenesis, suggesting that DNA methylation analysis may be a valuable source for breast cancer biomarkers. This work aimed to characterize known methylation biomarkers, such as the prognostic biomarkers: TFF1, PITX2 and uPA and the diagnostic biomarkers: RASSF1A, LIMK1, SLIT2, SLITRK1 and HS3ST2. In addition, candidate genes were analyzed in order to identify novel biomarkers. The PITX2 gene drives three transcripts: PITX2 A, B and C. The isoform C is regulated by an alternative promoter. The analysis of breast cancer cell lines reveal a correlation of methylation of the promoter regions and the expression of the respective transcripts. It has been shown that promoter methylation of the transcript variants A and B is a stronger prognostic biomarker as compared with the methylation of the promoter of the variant C. The analysis of tumors from 384 breast cancer patients in the course of a DNA microarray study led to the identification of promoter methylation of the genes BMP4, NR5A1, BARX1 and FGF4 as biomarkers, which allow for a prediction of disease outcome in lymph node positive, steroid-hormone receptor-positive breast cancer patients, who have received adjuvant anthracycline-based chemotherapy. Up to now, it has not been clear how the different components of the cancerous tissue contribute to the observed methylation. Laser microdissection is a technology which allows for the isolation of distinct cells but does not provide sufficient material for most standard methylation assays. An additional challenge has been encountered for samples from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues, which contain only fragmented DNA of poor quality. Therefore, a method to analyze several genes simultaneously in a limited number of cells dissected from sections from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues was developed. This method comprises: 1. an optimized bisulfite treatment protocol suitable for the conversion of DNA obtained from a few cells, 2. sequential PCR amplifications, and 3. a novel method for quantitative bisulfite sequencing based on the incorporation of a normalization domain into the PCR product. The method was used to analyze the methylation of the genes PITX2, RASSF1A, uPA, LHX3, PITX3, LIMK1, SLITRK1, SLIT2, HS3ST2 and TFF1 in three selected cases of invasive ductal carcinoma of the breast. The microdissected samples were obtained from intraductal and invasive carcinoma, stroma, tumor infiltrating lymphocytes, adipose tissue, chest wall muscle, adenosis, and normal ductal epithelia. All analyzed genes showed hypermethylation in invasive and intraductal carcinoma cells as compared to other tissue components with the exception of TFF1, which showed inverse methylation. Some genes showed low level methylation in normal adjacent breast tissue and tumor infiltrating lymphocytes. The methylation of the individual genes varied little within one tissue type and between different blocks from one case of breast cancer. The developed method is a powerful new tool for analyzing the methylation of multiple markers in different microdissected tissue components and may help to investigate different transitional states of breast and other cancers. However, this method is suitable for many applications beyond laser microdissection analysis, such as methylation analysis of several genes in body fluids (serum, plasma, urine), lavages, disseminated cancer cell, embryonic cells, isolated stem cells and so forth.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-18192
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2123
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1826
Exam Date: 5-Feb-2008
Issue Date: 11-Apr-2008
Date Available: 11-Apr-2008
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Brustkrebsbiomarker
DNA Methylierung
Lasermikrodissektion
Multiplexierte Analyse
Quantitative Bisulfitsequenzierung
Breast cancer biomarker
DNA methylation
Laser microdissection
Multiplexed analysis
Quantitative bisulfite sequencing
Usage rights: Terms of German Copyright Law
Appears in Collections:Fakultät 3 Prozesswissenschaften » Publications

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Dokument_43.pdf16.63 MBAdobe PDFThumbnail
View/Open


Items in DepositOnce are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.