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Main Title: Entwicklung und Anwendung thermisch schaltbarer Polymere auf Oberflächen zur Beeinflussung der Zelladhäsion
Translated Title: Development and application of thermo-responsive polymers on surfaces for the control of cell adhesion
Author(s): Ernst, Oliver
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: In der zellulären Biotechnologie besteht eine große Nachfrage nach Methoden für eine möglichst schonende Handhabung von Zellen. Ein wichtiger Ansatz hierfür ist die kontrollierte und schonende Ablösung adhärenter Zellen von Oberflächen, um zelluläre Veränderungen zu vermeiden. Die vorliegende Arbeit erweitert bisherige Ansätze thermoresponsiver Polymeroberflächen hinsichtlich der Erzeugung und Anwendung mit besonderem Blick auf die Einzelzellablösung. Im Fokus dieser Arbeit stand, die Erzeugung thermoresponsiver Polymeroberflächen zu erleichtern und eine exakte Kontrolle über Zellen mit unterschiedlichem Adhäsionsverhalten durch einstellbare Oberflächeneigenschaften zu ermöglichen. Das thermoresponsive Copolymer Poly(N-isopropylacrylamid)-poly(ethylenglykol) PNIPAAm-PEG(15%)-SH (P15) wurde an Goldoberflächen (P15-Au) gebunden, um eine Kontrolle über die Zelladhäsion zu gewährleisten. Die Kontaktwinkeldaten von P15-Au lassen eine Änderung der Oberflächenbenetzbarkeit erkennen, welche dem Übergang von einem hydratisierten (bei 20 °C) zu einem dehydratisierten Polymerzustand (bei 45 °C) entspricht. L929 Fibroblasten konnten gut auf P15-Au bei 37 °C kultiviert werden und rundeten sich bei Temperaturänderung auf 25 °C innerhalb von 30 Minuten von der Oberfläche ab. Durch die Integration von P15-Au in ein mikrofluidisches System konnte die für eine komplette Zellablösung notwendige Kraft kontrolliert werden. Auf P15-Au wurde Fibronektin strukturiert aufgebracht, um ein Substrat mit einem zellattraktiven und einem schaltbaren Bereich herzustellen. Dadurch konnten die Zellen, die auf die zellattraktiven Fibronektinbereiche migrierten, von den Zellen getrennt werden, die auf den schaltbaren Polymerbereich verweilten. Für die Optimierung der Schaltkinetik und der Schalteffizienz von schaltbaren Polymeroberflächen wurde ein neues Copolymer mit einem intramolekularen PEG-Gehalt von 19%wt an Goldoberflächen gebunden (P19-Au). Bei 25 °C war die Ablösung adhärenter Fibroblasten bei gleich bleibendem Zellabrundungsanteil doppelt so schnell wie auf P15-Au. Da stark adhärente Zellen (z.B. Osteoblasten) auf P19-Au bei Temperaturwechsel (37 °C → 25 °C) sich nicht abrundeten bzw. ablösten, wurde P19-Au mit dem zellrepellierendem Polymer CH3O-PEG-SH (PG) modifiziert (P19/PG-Au). Die Daten der Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) bestätigten die erwartete Oberflächenzusammensetzung von P19-Au und der modifizierten P19/PG-Au. Der Vergleich der Kontaktwinkeldaten beider Polymeroberflächen zeigte, dass die Schaltbarkeit von P19/PG-Au durch die Modifikation mit PG nicht verändert wurde. Ca. 74 % der stark adhärenten MG63 Zellen lösten sich nach Temperaturänderung innerhalb von 30 Minuten von der Oberfläche. Um die Kultivierungsdauer für schwach adhärente Zellen auf P19-Au zu verkürzen, wurde P19-Au mit dem Fibroblasten-attraktiven Peptidmotiv CGGRGDS (RGD) modifiziert (P19/RGD-Au). Bei Temperaturänderung war der Abrundungsanteil adhärenter Zellen auf dieser Oberfläche vergleichbar mit dem Zellabrundungsanteil auf P19-Au.
In cellular biotechnology there is a great demand on methods for a gentle handling of cells. Therefore, an important approach is a controlled and gentle detachment of adherent cells on surfaces to avoid changes of cell morphology. The present work broadens previous approaches of thermo-responsive polymeric surfaces regarding the development and application for the detachment of single cells. The development of thermo-responsive polymeric surfaces was facilitated and a detailed control of cells with different adhesion behaviour was achieved due to tunable surface properties. The thermo-responsive copolymer poly(N-isopropylacrylamide)-poly(ethylene glycol) PNIPAAm-PEG(15%)-SH (P15) was grafted to a gold surface (P15-Au) to allow a control of the cell adhesion process. Contact angle measurements of P15-Au exhibited a change of the surface wettability, which is consistent with a transition from a hydrated (20 °C) to a dehydrated state (45 °C) of the polymeric surface. L929 fibroblasts were cultivated on P15-Au at 37 °C and rounded upon temperature reduction to 25 °C within 30 minutes. In order to quantify the capability of the copolymer layer to induce cell detachment, defined shear forces were applied to the cells. For this purpose, the laminar flow in a microfluidic device is used. For the preparation of a substrate with a cell-attractant and a switchable region, Fibronectin was stamped on the P15-Au using microcontact printing. On this microstructured surface L929 fibroblasts migrated on the cell-attractant Fibronectin region and were separated from those remaining on switchable polymeric region. A new copolymer with an intramolecular PEG-content of 19%wt was grafted to a gold surface (P19-Au) for the optimization of the switching kinetic and the switching efficiency of switchable polymeric surfaces. At 25 °C, the duration until cultivated fibroblasts detached from pure P19-Au surfaces was half of the one determined on P15-Au. Strongly adherent human osteosarcoma cells could not be detached from pure P15-Au and P19-Au surfaces by decreasing the temperature (37 °C → 25 °C). Therefore, P19-Au was modified with the cell-repellent polymer CH3O-PEG-SH (PG) (P19/PG-Au). X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) on P19-Au and P19/PG-Au confirmed the expected layer composition. Contact angle measurements on P19/PG-Au showed that the switching ability was not influenced by the modification through PG. About 74% of the strong adherent MG63 cells detached from the surface within 30 minutes after temperature reduction. In order to shorten the cultivation duration for weak-adherent cells on P19-Au, the surface was modified with the cell-attractive peptide CGGRGDS (RGD) P19/RGD-Au. Upon temperature reduction the amount of cell rounding on this surface was comparable to those determined on P19-Au.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-19143
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2212
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1915
Exam Date: 23-Jun-2008
Issue Date: 29-Jul-2008
Date Available: 29-Jul-2008
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Mikrofluidik
Mikrostrukturierte Oberflächen
SAM
Schaltbare Oberflächen
Zelladhäsionskontrolle
Control of cell adhesion
Microfluidic device
Microstructured surfaces
SAM
Thermo-responsive surfaces
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