Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1988
Main Title: Interactions of the sterol and lipid biosynthetic pathways in yeast
Translated Title: Interaktionen von Sterol und Lipidbiosynthese Pathways in Hefe
Author(s): Shin, GaHee
Advisor(s): Lang, Christine
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Um neue Interaktionen zwischen dem Sterol- und anderen Lipidbiosynthesewegen zu identifizieren, wurde Saccharomyces cerevisiae genetisch verändert und der Gehalt der Fettsäuren und der Sterole wurde indiesen Stämmen untersucht. Die Überexpression von ACC1 im Wildtypstamm und im HMG-deregulierten (Squalen anreichernden) Stamm erhöhte in beiden Fällen, aufgrund der Co-Regulation der Gene ACC1 und HMG1, den Gehalt an Sterolen. Jedoch verringerte sich der Fettsäuregehalt im HMG-deregulierten Stamm, wohingegen es im Wildtypstamm umgekehrt war. Im Squalen-überproduzierenden Stamm könnte das Gen HMG1 eher als das Gen ACC1 eine Rolle darin spielen, den Gehalt an Squalen sowie an Sterolen zu erhöhen, wobei aber die Gesamtmenge an Fettsäuren nicht erhöht wird. Der Grund dafür ist die abgeschwächte Transkription von ACC1. Die Expressionsprofile, die mittels Mikroarrays bestimmt wurden, zeigten, dass die Überexpression von ACC1 im Wildtypstamm zur Eröhung der Transkription von Genen der Fettsäurebiosynthese (ACC1, FAS1) und der Ergosterolbiosynthese (ERG11, ERG28, ERG5, ERG2, ERG20) führt. Diese Ergebnisse unterstützen die Beobachtung, dass es im ACC1 überexprimierenden Stamm zu einer Anreicherung von Zymosterol und gesättigten Fettsäuren kommt. Die signifikant veränderte Expressionshöhe von ACC1, die mittels der Mikroarrays beobachtet wurde, führte zu einem modulierten Gehalt von Proteinen, die in der Sphingolipid- und Sterolbiosynthese in der Hefe eine Rolle spielen. Der Zusammenhang zwischen Sterol- und Sphingolipidbiosyntheseweg wurde durch das Programm Pathway StudioTM gezeigt. Im Fermentationsansatz führt die Überexpression von ACC1 zu einer signifikant erhöhten Synthese von Squalen und zu einem gemäßigt höheren Level an Ergosterolvorläufermolekülen, wohingegen der Ergosterolgehalt etwas geringer war als im Wildtyp. Die Co-Regulation von ACC1 und von HMG1 kann auch in der Fermentation als erfolgreich betrachtet werden, aber es scheint keinen Effekt auf die folgenden Schritte der Sterolbiosynthese zu haben. Eine Fermentation mit erhöhtem Sauerstoffgehalt scheint beim Wildtypstamm den Ergosterolgehalt erhöht zu haben. Der Verlauf des Ergosterolgehaltes über die Fermentationszeit zeigte jedoch, dass ein etwas höherer Ergosterolgehalt pro g Trockengewicht bereits nach ungefähr 45 Stunden beobachtet wurde. Zu diesem Zeitpunkt jedoch war die Biomasse (mit ungefähr 7mg/ml) verglichen mit der Biomasse zum Zeitpunkt der Ernte (ungefähr 13mg/ml) niedrig. Die erhöhte Glutamat-Fütterung führte zu etwas höheren Wachstumsraten und Biomassegehalten zum Erntezeitpunkt. Während der Fermentation wurde nach ca. 40 Stunden ein sehr hoher Ergosterolgehalt beim Wachstum in Medium mit hohem Glutamatgehalt ermittelt. Dies legt nahe, dass der Grund dafür eine allgemein erhöhte metabolische Aktivität ist, die die Sterolsynthese durch erhöhten Glutamatgehalt unterstützt. Der zusätzliche Stickstoff hat das Potenzial sowohl die Ergosterolausbeute zu erhöhen als auch die Fermentationszeit zu verkürzen. Um die Produktion von Ergosterol und anderer Lipide zu verbessern, wurde die optimale Flussverteilung mit pgi gene-knockout (lineares Programm) vorausberechnet. Die Gesamtzunahme der Ergosterolmenge wurde, durch das Flussbalance-Modell der Lipidstoffwechselprozesse, auf ungefähr das 2,38-Fache berechnet.
To identify new interactions between the sterol and other lipid biosynthesis Saccharomyces cerevisiae was constructed by genetically modification and the content of fatty acid and sterol was investigated in those strains. The overexpression of ACC1 in wild type and squalene-overproducing strains individually increased clearly the content of sterols due to co-regulation between ACC1 and HMG1 genes. However, the content of fatty acids was decreased in squalene overproducing strain and vice versa in wild type strain. In squalene-overproducing strain, HMG1 gene might play a role to increase the content of squalene as well as sterol in preference to ACC1 gene, but the total fatty acids did not increase due to weakened transcription level of ACC1. The expression profiles observed by microarray showed that the genes overexpressed in ACC1-overexpressing strain compare to wild type were ACC1, FAS1 and ERG11, ERG28, ERG5, ERG2, ERG20 genes, supporting the increase of zymosterol and saturated fatty acids in ACC1-overexpressing strain. The significantly altered ACC1 expression level identified by microarray resulted in modulated level of proteins involved in sphingolipid and sterol biosynthesis in yeast. The relationship between sterol and sphingolipid was shown by the Pathway StudioTM program. In fermentation, the overexpression of ACC1 gene induced a significantly higher expression level of squalene, a moderately higher level of ergosterol precursors while the ergosterol level was slightly lowered. The co-regulation of ACC1 and HMG1 can also be regarded as successful in fermentation, but it does not seem to have an effect on the following steps of sterol biosynthesis. Oxygen addition fermentation of the wild type strain seems to have increased the ergosterol content. The course of the ergosterol content (over fermentation time), however, showed that a slightly higher content of ergosterol per g dry weight was observed already before about 45h. At that (time) point however the biomass was quite low (about 7mg/ml) compared to the final biomass (about 13mg/ml). The increased glutamate feeding induced slightly higher growth rates and final biomass contents. After 40 hours of fermentation very high ergosterol contents were detected on high glutamate containing medium, suggesting a generally increased metabolic activity that supports sterol synthesis by increased glutamate content. The additional nitrogen has the potential to both increase ergosterol yield and shorten fermentation time. In order to improve production of ergosterol and other lipid compounds, the optimal flux distribution was realized with pgi gene knockout (Linear program). The overall increase of ergosterol was calculated to be about 2.38 fold by the flux-balance model of lipid metabolite processes.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-20427
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2285
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-1988
Exam Date: 18-Sep-2008
Issue Date: 2-Oct-2008
Date Available: 2-Oct-2008
DDC Class: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
Subject(s): Fermentation
Flux Balance Analyse
Hefe
Lipid
Mikroarray
Fermentation
Flux Balance Analysis
Lipids
Microarray
Yeast
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