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Main Title: Zur Rolle des Genproduktes PA1991 bei der Regulation des Ethanol-oxidierenden Systems von Pseudomonas aeruginosa
Translated Title: The role of geneproduct PA1991 in the regulation of the ethanol-oxidizing system of Pseudomonas aeuginosa
Author(s): Hempel, Niels
Advisor(s): Görisch, Helmut
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: P. aeruginosa synthetisiert aerob auf Ethanol eine Quinoprotein-Ethanoldehydrogenase (QEDH; kodiert von exaA), eine NAD+-abhängige Acetaldehyd-DH (kodiert von exaB), ein Cytochrom c550 (kodiert von exaC) und den Kofaktor PQQ (kodiert von pqqABCDE). An der Regulation dieser Komponenten ist ein hierarchisch aufgebautes System aus Sensorkinasen und Responsregulatoren beteiligt: Das Zweikomponentensystem ExaDE kontrolliert die Transkription von exaA. Der Responsregulator AgmR steuert die Transkription von exaBC, exaDE und pqqABCDE. Der Responsregulator PA3604 aktiviert als genereller Regulator die Transkription von agmR. Die eisenabhängige ADH kodiert von PA1991 wurde in dieser Arbeit als regulatorisches Enzym zur Induktion des Ethanol-oxidierenden Systems identifiziert. Das Enzym oxidiert 1,3-Propandiol und andere Alkohole. Das Gen PA1991 wurde durch Insertionsmutagenese inaktiviert. Die erzeugte Mutante NH1 konnte auf Ethanol erst nach einer extrem langen lag-Phase wachsen. Das schlechte Wachstum der Mutante NH1 korrelierte mit den gemessenen geringen Enzymaktivitäten im Rohextrakt. Nach Induktion auf Ethanol waren in der NH1-Mutante keine QEDH-Aktivität und nur eine stark reduzierte Aktivität für eine eisenabhängige ADH nachweisbar. Nach Komplementation mit dem intakten Gen PA1991 wurde das Wachstum des Wildtypes wieder hergestellt. Weitergehende Analysen mit Reportergenkonstrukten ergaben in der Mutante NH1 eine verringerte Transkription der Gene des Ethanol-oxidierenden Systems agmR, exaDE, exaA, exaBC und pqqABCDE im Vergleich zum Wildtyp. In der Mutante NH1 verstärkte die konstitutive Expression von ExaDE die Transkription von exaA und die konstitutive Expression von AgmR die Transkription von exaA, exaBC und pqqABCDE. Das Gen PA1991 bildet mit dem stromabwärts gelegenen Gen PA1992 (kodiert für eine Sensorkinase) ein Operon. Mit Hilfe von Reportergenkonstrukten sowie durch Identifizierung einer gemeinsamen mRNA wurde die Transkriptionseinheit der beiden Gene bestätigt. Die Gene PA1991 und PA1992 werden koexprimiert, eine direkte Wechselwirkung der beiden Proteine konnte jedoch nicht nachgewiesen werden. Die Transkription des Operons PA1991/PA1992 wird auf kurzkettigen Alkoholen mit Hilfe des Responsregulators PA3604 aktiviert. Bei inaktiviertem Gen PA3604 (Mutante MD1) wurde das Operon PA1991/PA1992 nicht mehr transkribiert.
P. aeruginosa produces aerobically on ethanol a quinoprotein ethanol dehydrogenase (QEDH; encoded by exaA), a NAD+-dependent acetaldehyde DH (encoded by exaB), a cytochrome c550 (encoded by exaC) and Cofactor PQQ (encoded by pqqABCDE). Hierarchically arranged sensor kinases and response regulators are involved in the regulation of these components. The two-component system ExaDE controls transcription of exaA. The response regulator AgmR controls transcription of exaBC, exaDE and pqqABCDE. A general response regulator encoded by PA3604 activates transcription of agmR. In this work the iron-dependent ADH PA1991 was identified as regulatory enzyme for induction of the ethanol oxidation system. The enzyme oxidizes 1,3-propanediol and other alcohols. Gene PA1991 was inactivated by insertion mutagenesis. The isolated mutant NH1 was growing on ethanol with an extreme prolonged lag phase. The poor growth of mutant NH1 correlated with low enzyme activities in crude extracts. In mutant NH1 no QEDH activity was found after induction on ethanol and activity of iron-dependent ADH was drastically reduced. After complementation with intact gene PA1991 growth of wild type was restored. Further experiments with reportergene constructs demonstrated reduced transcription in mutant NH1 of the genes agmR, exaDE, exaA, exaBC and pqqABCDE of the ethanol-oxidizing system. The constitutive expression of ExaDE in the mutant NH1 increased the transcription of exaA and constitutive expression of AgmR increased the transcription of exaA, exaBC and pqqABCDE. Gene PA1991 forms an operon with the downstream located gene PA1992 encoding a sensor kinase. The transcriptional unit of both genes was demonstrated by reportergene constructs and by identification of a common mRNA. Proteins PA1991 and PA1992 are coexpressed, but do not form a protein complex. On short-chain alcohols the operon PA1991/PA1992 was induced. This induction depends on an intact response regulator encoded by PA3604. With inactivated gene PA3604 (mutant MD1) a transcription of this operon was not detected.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-20542
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2298
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2001
Exam Date: 24-Jun-2008
Issue Date: 24-Oct-2008
Date Available: 24-Oct-2008
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): AgmR
Ethanol-oxidierendes System
Fe-ADH
Quinoprotein
Sensorkinase
AgmR
Ethanol-oxidizing system
Fe-ADH
Quinoprotein
Sensor kinase
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