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Main Title: Periphere CD4-positive T-Zellantworten bei Morbus Crohn und Spondylitis ankylosans nach in vitro-Stimulation mit evolutionär konservierten Proteinen oder mit Pathogenitätsfaktoren von Escherichia coli
Translated Title: Peripheral CD4-positive T cell responses in Crohn’s disease and ankylosing spondylitis upon in vitro stimulation with conserved proteins or with pathogenicity factors of Escherichia coli
Author(s): Ergin, Asgar
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Die Ätiologie von Chronisch Entzündlichen Darmerkrankungen (CED) wie Morbus Crohn (M. Crohn) und Colitis ulcerosa ist nicht vollständig geklärt. Es wird angenommen, dass es sich um eine multifaktorielle Erkrankung handelt, an deren Pathogenese genetische Faktoren, Umweltfaktoren und eine fehlregulierte mukosale Immunantwort gegen kommensale Bakterien beteiligt sind. Vermutlich ist Escherichia coli (E. coli) mit CED assoziiert. Zudem kreuzreagieren T-Zellen von CED-Patienten gegenüber verschiedenen Bakterienspezies, sodass diese T-Zellantworten vermutlich gegen konservierte bakterielle Proteine gerichtet sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden neben hochkonservierten Proteinen auch Pathogenitätsfaktoren von E. coli als Test-Antigene hergestellt, um abnormale T-Zellantworten bei Patienten mit M. Crohn und Spondylitis ankylosans (S. ankylosans) zu untersuchen. Sämtliche Proteine wurden zunächst in E. coli im kleinen Maßstab exprimiert und unter nativen Bedingungen mittels His-Tag affinitätschromatografisch gereinigt. Konservierte Proteine, deren Reinigung nur mit schwacher Ausbeute gelang, wurden mit MBP, GST und NusA fusioniert, da diese Fusionspartner die Löslichkeit und somit die Ausbeute des Fusionsproteins steigern können. Dagegen erfolgte die Reinigung der Pathogenitätsfaktoren mittels His-Tag unter denaturierenden Bedingungen. Nach Expression jedes Proteins im großen Maßstab erfolgte die Entfernung von Lipopolysaccharid aus den Proteinpräparationen mittels Polymyxin-B beschichteten magnetischen Kugeln. Insgesamt gelang es 197 konservierte Proteine und 13 Pathogenitätsfaktoren von E. coli mit der Mindestmenge von 500 µg herzustellen. Im anschließenden Vollblut-Assay wurden Gemische mit jeweils 10 konservierten Proteinen eingesetzt. Die Pathogenitätsfaktoren wurden einzeln getestet. Im Vergleich zu gesunden Kontrollpersonen konnten bei einer signifikant kleineren Zahl von Patienten mit M. Crohn und S. ankylosans CD4+ T-Zellantworten gegenüber einer Reihe von Proteingemischen beobachtet werden. Zudem reagierten Patienten mit M. Crohn und S. ankylosans gegenüber dem Superantigen Staphylococcus aureus enterotoxin B mit signifikant geringeren Frequenzen von CD4+ T-Zellen. Diese Ergebnisse sprachen eher für eine generelle Immunsuppression als Grund für die niedrige T-Zellantwort. Jedoch konnten diese niedrigen T-Zellantworten nach Stimulierung mit den „Recall-Antigenen“ Cytomegalievirus Phosphoprotein 65 kDa und Tetanus Toxoid nicht bestätigt werden. Möglicherweise lassen sich diese letzteren Ergebnisse so deuten, dass bei M. Crohn und S. ankylosans die E. coli-spezifischen T-Zellen selektiv an den Ort der Entzündung (Darm) rekrutiert und dort spezifisch gebunden werden, jedoch nicht andere antigenspezifische T-Zellen.
Crohn’s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) are the two phenotypic prototypes of Inflammatory Bowel Disease (IBD). The etiology of IBD remains elusive. However, genetic and environmental factors and a dysregulated mucosal immune response towards commensal bacteria are believed to contribute to the pathogenesis of IBD. It appears probable that Escherichia coli (E. coli) is associated with IBD. In addition, T cell clones of IBD patients have been shown to cross react towards different bacterial species, indicating that conserved antigens of intestinal bacteria could promote chronic inflammation directly or via induction of autoimmunity. In the course of this doctoral thesis, highly conserved proteins and pathogenicity factors of E. coli were expressed and purified for testing in a T cell assay in order to analyze abnormal T cell responses in patients with CD and ankylosing spondylitis (AS). Initially, all proteins were expressed in small-scale in E. coli and purified under native conditions via His-tag affinity chromatography. Where this procedure resulted in low yields of purified proteins, the respective target proteins were fused with MBP, GST, and NusA in order to improve the solubility of the fusion protein. In contrast, pathogenicity factors were purified via His-tag affinity chromatography under denatured conditions. After large-scale expression, bacterial lipopolysaccharide was removed from each protein preparation by means of Polymyxin-B coated magnetic beads. In total, 197 conserved proteins and 13 pathogenicity factors of E. coli could be purified with the minimum amount of 500 µg. In the whole blood assay, pools - each containing 10 conserved proteins - and single pathogenicity factors were tested. Upon stimulation with several pools, a small, but statistically significant number of patients with CD and AS responded with CD4+ T cells in comparison with healthy individuals. Moreover, patients with CD and AS responded to the superantigen Staphylococcus aureus enterotoxin B with significantly decreased frequencies of CD4+ T cells. These findings indicated that the decreased T cell responses might be a result of a general immunosuppression. However, upon stimulation with the “recall antigens” Cytomegalovirus Phosphoprotein 65 kDa and Tetanus Toxoid, decreased CD4+ T cell responses could not be confirmed in patients with CD and AS. Possibly, the latter finding might be explained by a recruitment of E. coli-specific T cells to the source of inflammation (intestine) in patients with CD and AS.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-22155
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2437
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2140
Exam Date: 30-Mar-2009
Issue Date: 21-Apr-2009
Date Available: 21-Apr-2009
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): CD4+ T-Zellen
Chronisch Entzündliche Darmerkrankungen
E. coli
Konservierte Proteine
Morbus Crohn
CD4+ T cell
Conserved proteins
Crohn's disease
E. coli
Inflammatory Bowel Disease
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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