Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2161
Main Title: An integrative approach to identify novel target genes for reduction of diacetyl production in lager yeast
Translated Title: Ein integrativer Ansatz zur Identifizierung von neuen Zielgenen für die Reduktion der Diacetylproduktion in untergärigen Brauhefen
Author(s): Duong, Cam Thuy
Advisor(s): Stahl, Ulf
Nevoigt, Elke
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Diacetyl ist ein Nebenprodukt der Biosynthese von Valin und verursacht einen butterartigen Geschmack im Bier. Die Reduktion der Diacetylproduktion ist eine der wichtigsten Ziele der Stammoptimierung von Brauhefen, da sie hilft, die Lagerzeit zu verkürzen und die Bierproduktion zu beschleunigen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Reduzierung der Diacetylproduktion in untergärige Brauhefen mittels Inverse Metabolic Engineering. Ein Vorteil dieser Herangehensweise gegenüber dem rationalen Metabolic Engineering ist die Tatsache, dass es kein Vorwissen über die zellulären Subsysteme in Brauhefen erfordert. Darüberhinaus erlaubt es die direkte Nutzung von industriellen Stämmen und industriell relevanten Bedingungen sowie die Generierung von selbstklonierten Stämmen. Verschiedene untergärige Brauhefestämme mit unterschiedlicher Diacetylproduktion wurden selektiert: i) ein Produktionsstamm (Stamm C), ii) ein Stamm der nah verwandt ist zu dem Produktionsstamm (Stamm A) und dessen Diacetylproduktion etwas höher ist als die von Stamm C und iii) Stamm B der wesentlich weniger Diacetyl bildet als die anderen Stämme. Die genetische Basis der selektierten Stämme wurde in einem integrativen Ansatz verglichen, der globale Analysen auf verschiedenen molekularen Ebenen beinhaltete, d.h. die Kopiezahl von Genen (analysiert durch Microarray-basierte vergleichende Genomhybridisierungen), mRNA-Konzentrationen (mittels Microarray-basierten vergleichenden Transkriptomanalysen) und Proteinkonzentrationen (zweidimensionale Gelelektrophorese und Massenspektrometrie). Die vergleichenden Genom- und Transkriptomanalysen deckten potentielle Zielgene für die Reduktion der Diacetylproduktion in untergärigen Brauhefen auf, d.h. Sc-ILV6, Sc BAT1, non Sc BAT1, non-Sc-BAT2. Es wird angenommen, dass Ilv6p eine regulatorische Untereinheit von Ilv2p ist, einem Enzym, welches für die Bildung von  Acetolaktat verantwortlich ist, dem Precursor von Diacetyl. Die Kopiezahl und die mRNA-Konzentration des Sc-ILV6 Gens waren geringer in Stamm B verglichen mit den anderen Stämmen. Die Rolle von Sc ILV6 in der Diacetylbildung wurde durch Genetic Engineering verifiziert. Die Deletion der beiden Sc-ILV6 Kopien im Produktionsstamm C führte zu einer signifikanten Verminderung der Diacetylkonzentration um 65% unter industriell relevanten Braubedingungen. Verglichen mit dem Referenzbier zeigte das Jungbier, welches mit der Sc-ilv6/Sc-ilv6 Doppelmutante gebraut wurde, leichte Änderungen in den Konzentrationen von einigen höheren Alkoholen, Estern, Fettsäuren und Acetaldehyd. Nichtsdestoweniger lagen die Konzentrationen dieser Nebenprodukte im normalen Bereich für untergärige Biere und es wurde kein signifikanter Unterschied im Geschmack des Bieres, welches mit der Sc-ilv6/Sc-ilv6 Doppelmutante hergestellt wurde, und dem Referenzbier festgestellt.
Diacetyl is a by product of the valine biosynthetic pathway which causes an unwanted butter flavour in beer. The reduction of diacetyl production is one of the most relevant targets for brewer’ yeast strain improvement since it helps to shorten the maturation process and thereby enabling an acceleration of lager beer production. The aim of this thesis is to reduce diacetyl production in lager brewers’ yeast by means of inverse metabolic engineering. One advantage of this method over the rational metabolic engineering is that it does not require preliminary knowledge about cellular subsystems in lager yeast. Moreover, it allows the direct usage of industrial strains under industrial relevant conditions as well as the creation of self-cloned strains. Different lager yeast strains producing various levels of diacetyl were selected included i) one production strain (strain C), ii) one strain closely related to the production strain (strain A) whose diacetyl level is slightly higher than strain C and iii) strain B which has much lower level of diacetyl production compared to the others strains. The genetic bases of the selected strains were compared via an integrative approach using global analyses at different molecular levels i.e. gene copy numbers (analysed by microarray based comparative genome hybridisation), mRNA concentrations (via microarray based comparative transcriptome analysis) and protein abundance (two dimensional gel electrophoresis plus mass spectrometry). The comparative genome and transcriptome studies revealed potential target genes for reduction of diacetyl production in lager yeast i.e. Sc-ILV6, Sc BAT1, non Sc BAT1 and non Sc BAT2. Sc-Ilv6p is proposed to be the regulatory subunit of Ilv2p, the enzyme which is responsible for the formation of -acetolactate, the precursor of diacetyl. The levels of Sc-ILV6 gene copies number and mRNA were found to be less abundant in strain B compared to other strains. The role of Sc ILV6 in diacetyl formation was verified by genetic engineering. The disruption of Sc ILV6 in the production strain C resulted in a significant reduction of diacetyl formation by 65% under conditions relevant to industrial brewery fermentations. Compared to the reference beer, the green beer produced by Sc-ilv6 mutant showed slight alterations in the concentrations of acetaldehyde and some fusel alcohols, esters and fatty acids. Nevertheless, the levels of these by products are in the normal range for lager beer and no significant difference in the taste of the beer produced by the Sc-ilv6 mutant and the wildtype was detected.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-22477
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2458
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2161
Exam Date: 26-Feb-2009
Issue Date: 29-May-2009
Date Available: 29-May-2009
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Brauhefe
Diacetyl
Proteom
Saccharomyces
Transkriptom
Brewers' yeast
Diacetyl
Proteome
Saccharomyces
Transcriptome
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