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Main Title: Expression und intrazelluläre Verteilung von Zellzyklusproteinen sowie der pRb-Phosphorylierung in Tumorzelllinien
Translated Title: Expression and intracellular localization of cell cycle proteins as well as phosphorylation of pRb in tumor cell lines
Author(s): Schmalowsky, Janine
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Die High-Content-Analyse (HCA) wird in der Pharmaindustrie zur parallelen Analyse verschiedener komplexer intrazellulärer Mechanismen nach Einwirkung externer Einflüsse (Substanzen) eingesetzt. Gegenstand dieser Arbeit war es, die Expression und intrazelluläre Lokalisation zellzyklusregulatorischer Proteine sowie die Phosphorylierung von pRb in den einzelnen Zellzyklusphasen zu analysieren und die Wirkung von CDK-Inhibitoren auf diese Prozesse zu charakterisieren. 1. Dazu wurde die Technologie der „self-labeling tags“ (SNAP-tagTM, HaloTag®) im Hinblick auf ihre alternative Anwendung zu autofluoreszierenden Proteinen untersucht. Die Expression des SNAP-tagTM führte jedoch zu einer Verlängerung der S-Phase und disqualifizierte diesen damit für Zellzyklusstudien. Der HaloTag® zeigte in fixierten Zellen eine mit YFP vergleichbare Transfektionseffizienz, Signalstärke sowie ein identisches Verhalten in der Zellzyklusregulation. Damit eignet sich der HaloTag® für den lizenzfreien und flexiblen Einsatz in der HCA. 2. Mittels automatisierter Bildanalysealgorithmen wurde die zellzyklusabhängige Expression und Verteilung der endogenen und transient überexprimierten Proteine CDK2, CDK4, Cyclin D1 und Cyclin E1 in verschiedenen Tumorzelllinien (HeLa, MCF-7, PC3) untersucht. Die endogenen Proteine konnten während der gesamten Interphase exprimiert sowie im Zellkern lokalisiert sein. Die ausgeprägte Kernlokalisation der Cyclin/CDK-Komplexe impliziert, dass sie in die funktionelle Dysregulation des Zellzyklus von Tumorzellen involviert sind. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass transient exprimierte Cycline anderen Degradationsmechanismen unterliegen als endogene Cycline sowie endogen und transient exprimierte CDKs. 3. Nahezu alle veränderten Kontrollmechanismen, wie sie in Tumorzellen gefunden werden, betreffen den Übergang von einer Zellzyklusphase in die nächste, wobei der Übergang von der G1- in die S-Phase und damit die Funktion der Cyclin D/CDK4 bzw. Cyclin E/CDK2-Komplexe sowie der pRb-E2F-Signalweg besonders häufig involviert sind. Daher wurde die CDK4-abhängige Phosphorylierung von pRb (Ser807/811) mit Hilfe eines Bildanalysealgorithmus untersucht. Die pRb (Ser807/811)-Moleküle konnten ausschließlich in Interphase-Zellkernen der untersuchten Tumorzelllinien nachgewiesen werden. 4. Ausgehend von diesen Voruntersuchungen wurde ein neuer funktioneller HCA-Assay entwickelt, mit dem die CDK4-YFP-abhängige pRb (Ser807/811)-Phosphorylierung durch potentielle CDK-Inhibitoren analysiert werden kann. Hierbei dient die Zahl der pRb (Ser807/811)-Moleküle als Maß für die CDK4-Aktivität und somit reziprok für die Wirksamkeit potentieller CDK4-Inhibitoren im zellulären Assay.
High-Content Analysis (HCA) is an established tool in pharmaceutical industry and facilitates the parallel analysis of multiple cellular parameters after compound treatment. Aim of this thesis was the analysis of cell cycle-dependent expression and intracellular localization of cyclin D1/CDK4-, Cyclin E1/CDK2-complexes and phosphorylation of pRb as well as effects of potential CDK-inhibitors on these processes. 1. Self-labeling protein tags (SNAP-tagTM, HaloTag®) were tested for an alternative approach for labeling of live or fixed cells to well-known autofluorescent proteins. But intracellular expression of SNAP-tagTM resulted in an extended S-Phase. Therefore, SNAP-tagTM is non-applicable for cell cycle studies. In fixed cells HaloTag® and YFP showed comparable transfection rates as well as signal intensities and no impact on cell cycle regulation. That makes HaloTag® indeed a promising alternative to AFPs in HCA. 2. In different tumor cell-lines (HeLa, MCF-7, PC3) expression and intracellular localization of endogeneous and transiently transfected CDK2, CDK4, cyclin D1 and cyclin E1 were investigated. Automated image analysis enabled the quantification and correlation of expression and localization of target proteins regarding cell cycle dependence. During the entire interphase the investigated proteins were endogeneously expressed and located in cytoplasm and nucleus as well. The extraordinary localization of cyclin/CDK-complexes within the nucleus implies their participation in functional processes regarding the dysregulation of tumor cell cycle. Further it could be demonstrated that transiently expressed cyclin D1 and E1 are degraded by different mechanism than endogeneously expressed cyclins and endogeneously or transiently expressed CDKs. 3. Mechanisms controlling cell cycle progression and checkpoint function are often affected in cancer. G1/S transition and thus function of cyclin D/CDK4, cyclin E/CDK2 and pRb-E2F-pathway are mostly involved in tumorigenisis. Therefore cyclin D1/CDK4- and cyclin E1/CDK2-dependent phosphorylation of pRb (Ser807/811) in tumor cell lines were analyzed. With automated image analysis pRb (Ser807/811)-molecules were only detected in interphase-nuclei of investigated tumor cell lines. 4. Furthermore, the CDK4-YFP dependent phosphorylation of endogenous pRb (Ser807/811) was used to analyse the effect of potential CDK-inhibitors under cellular conditions in a new functional HCA assay. The intracellular phosphorylation of pRb was used as a read out parameter for the CDK4-activity and for the effect of the potential CDK4-inhibitors, respectively.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-22775
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2484
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2187
Exam Date: 11-Jun-2009
Issue Date: 30-Jun-2009
Date Available: 30-Jun-2009
DDC Class: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
Subject(s): Automatisierte Bildanalyse
HCA
Zellzyklus
Automated image analysis
Cell cycle
HCA
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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