Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2262
Main Title: Spontaneous and hepatic differentiation of human embryonic stem cells in 3D perfusion culture bioreactors
Translated Title: Spontane und hepatische Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen in 3D Perfusionskulturbioreaktoren
Author(s): Stachelscheid, Harald
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Humane embryonale Stammzellen (hESC) besitzen ein großes Potential als Zellquelle für Anwendungen in der Grundlagenforschung, bei der pharmakologischen Wirkstoffsuche, in der Toxizitätstestung und in zellbasierten Therapien in der regenerativen Medizin. Eine Grundvoraussetzung für solche Anwendungen ist die Verfügbarkeit von Methoden, mit denen sich Zellpräparationen von hoher Reinheit und ausreichender Zellzahl generieren lassen. Das Ziel des Projektes war die Untersuchung des Wachstums und der Differenzierung von hESC in einem Mehrkompartimentbioreaktorsystem für die 3D Zellperfusion. Ein Ziel dieser Studie bestand in der Untersuchung, inwieweit das Bioreaktorsystem die spontane Differenzierung von hESC in verschiedene Zelllinien und die Gewebebildung unterstützt sowie in dem Vergleich dieser Differenzierung mit der Teratombildung aus hESC in Mäusen. Ein weiteres Ziel dieser Studie war die Untersuchung der gerichteten Differenzierung von hESC in die hepatische Zelllinie. Hierzu wurde eine Methode, die ursprünglich zur gerichteten hepatischen Differenzierung von hESC in 2D Kulturen entwickelt worden ist, auf das 3D System übertragen und zwei Pilotexperimente durchgeführt. Die Ergebnisse der Experimente zur spontanen Differenzierung von hESC zeigten, dass die hESC sowohl in Zellen der drei Keimblätter als auch in Zellen der extraembryonalen Linien differenzierten und im Bioreaktor gewebeähnliche Strukturen bildeten. Der Vergleich dieser Gewebestrukturen auf RNA, Protein und histologischer Ebene mit den in Teratomen gebildeten Geweben zeigte eine sehr hohe Ähnlichkeit. In den beiden Pilotexperimenten zur hepatischen Differenzierung im Biorektorsystem ergaben sich keine signifikanten Anzeichen für eine hepatische Reifung, sondern eher für eine spontane Zelldifferenzierung. In zukünftigen Studien müssten deshalb die Konzentrationen der die hepatische Differenzierung beeinflussenden Faktoren in dem benutzten Differenzierungsprotokoll weiter optimiert werden. Die Studie ergab insgesamt, dass 3D-Perfusionsbioreaktoren eine Technologie darstellen, welche die spontane hESC Differenzierung ähnlich wie eine in vivo Umgebung unterstützt. Diese Bioreaktorsysteme könnten daher als eine in vitro Alternative zur in vivo Testung der Teratombildung, welche häufig angewandt wird um das Entwicklungspotential von pluripotenten Zellarten zu untersuchen, dienen. Die Anzahl von Tierversuchen ließe sich so reduzieren. Die definierten und kontrollierbaren Kulturbedingungen in 3D- Perfusionsbioreaktoren könnten auch genutzt werden, um verbleibende undifferenzierte Zellen in aus pluripotenten Zellen gewonnenen Zellpräparationen aufzuspüren, für die Entwicklung von Methoden zur Testung von Embryotoxizität und als ein in vitro System zur Untersuchung bestimmter Aspekte der Gewebeentwicklung.
Human embryonic stem cells (hESC) hold great potential as a cell source for applications in basic science, pharmacological drug screening, toxicity testing and cell- based therapies in regenerative medicine. For these, methods for the efficient generation of highly enriched specific cell preparations are key prerequisites. The goal of the project was to investigate growth and differentiation of hESC in a multicompartment bioreactor system for 3D cell perfusion. One aim of this study was to analyze the capacity of the bioreactor system to support spontaneous multilineage differentiation and tissue formation of hESC and to compare to teratoma formation of hESC in mice. Another aim of this study was the evaluation of the directed differentiation of hESC towards the hepatic lineage. For this purpose a method of directed hepatic differentiation that was originally developed for 2D cultures of hESC was translated to the 3D system and two pilot experiments were performed. Results of the experiments on the spontaneous differentiation showed that hESC differentiated into cells of the three germ layers as well as cells of the extraembryonic lineages and formed differentiated tissue-like structures. Comparison of these tissue structures with those formed in teratomas showed a high degree of similarity on the RNA, protein and histological levels. The results of the two pilot experiments on hepatic differentiation in the bioreactor system suggested no significant hepatic maturation but rather spontaneous differentiation. Therefore the concentrations of factors that influence hepatic differentiation used in the applied differentiation protocol have to be further optimized in future studies. The results of this study suggest that 3D perfusion bioreactors provide a technology supporting spontaneous hESC differentiation, similar to an in vivo environment. Therefore the bioreactor system could be used as an in vitro alternative for the in vivo teratoma formation assay that is commonly used to explore the developmental potential of pluripotent cell types and this way can help to reduce animal testing. Furthermore the defined and controllable culture conditions render the system suitable for applications such as the safety testing of remaining undifferentiated cells in cell preparations derived from pluripotent cells, the development of embryotoxicity testing methods and its use as an in vitro system to examine certain aspects of tissue development.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-23702
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2559
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2262
Exam Date: 2-Jul-2009
Issue Date: 6-Oct-2009
Date Available: 6-Oct-2009
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): Hepatozyt
Humane embryonale Stammzellen
Spontane Differenzierung
Teratom
Hepatocyte
Human embryonic stem cells
Spontaneous differentiation
Teratoma
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