Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2282
Main Title: Etablierung eines nicht-radioaktiven Inzisionstests zur Messung der DNA-Reparaturkapazität gegenüber oxidativen DNA-Schäden und der Einfluss von Kupfer und Cadmium
Translated Title: Establishment of a non-radioactive cleavage assay to assess the DNA repair capacity towards oxidative DNA damage and the impact of copper and cadmium
Author(s): Hamann, Ingrit
Advisor(s): Hartwig, Andrea
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Oxidativer Stress ist in die Entstehung vieler Krankheiten, u. a. auch Krebs involviert. In der molekularen Epidemiologie liegt somit ein wichtiger Fokus auf der Suche nach geeigneten Biomarkern, zu denen die Erfassung der potentiell mutagenen, oxidativen DNA-Läsion 8-Oxoguanin (8-oxoG) bereits zählt. Da 8-oxoG hauptsächlich von der humanen 8-oxoG-DNA-Glykosylase 1 (hOGG1) erkannt wird, könnte eine andere Herangehensweise in der Erfassung der Aktivität dieses wichtigen DNA-Reparaturproteins bestehen. So konnte in verschiedenen Studien eine Assoziation zwischen einer reduzierten hOGG-Aktivität und einem erhöhten Krebsrisiko gezeigt werden. In diesen Studien wurden bisher überwiegend Testsysteme angewandt, die auf der Inzision von 32P-markierten und 8-oxoG enthaltenden Oligonukleotiden beruhten. Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Etablierung eines nicht-radioaktiven Testsystems, da dies insbesondere für epidemiologische Studien eine Reihe von Vorteilen bietet. Verschiedene Oligonukleotidstrukturen, Zellextraktionsmethoden und Reaktionspuffer wurden miteinander verglichen und das Testsystem im Bezug auf Oligonukleotidmenge, Zellextraktmenge und Inkubationszeit optimiert. Durch Bestimmung der Inzisionsaktivität in von mehreren Probanden stammenden Lymphozyten-Extrakten konnten schließlich deutliche, inter-individuelle Unterschiede in der DNA-Reparaturkapazität gegenüber 8-oxoG gezeigt werden. Eine weitere Anwendung des Testsystems bestand in der Untersuchung der Effekte von Cadmium und Kupfer auf die Basenexzisionsreparatur, genauer gesagt auf die am Anfang dieses Reparaturwegs stehenden Proteine hOGG1 und APE1, da für beide Metalle gezeigt wurde, dass sie in Kulturzellen die Reparatur oxidativer DNA-Schäden empfindlich inhibieren. Während sich die isolierte APE1 als sehr resistent gegenüber einer Inkubation mit Cu(II) bzw. Cd(II) erwies, wurde die isolierte hOGG1 schon durch mehrfach niedrigere Konzentrationen an Cu(II) bzw. Cd(II) inhibiert. Die direkte Inkubation von Zellextrakten bestätigte diese Ergebnisse. In intakten Zellen wurde durch beide Metallverbindungen eine Inhibition der hOGG-Aktivität beobachtet, die eher auf eine direkte Interaktion mit dem BER-Protein, als auf eine Beeinflussung der Genexpression zurückgeführt werden konnte. Dagegen war selbst im stark zytotoxischen Konzentrationsbereich keine Erniedrigung der APE-Aktivität zu beobachten. Zusammenfassend wurde somit ein nicht-radioaktives Testsystem etabliert, das die sensitive Erfassung von inter-individuellen Unterschieden in der DNA-Reparaturkapazität und zusätzlich auch mechanistische Studien zu den DNA-Reparaturproteinen hOGG1 und APE1 ermöglicht.
Oxidative stress is involved in many diseases, and the search for appropriate biomarkers is one major focus in molecular epidemiology. 8-oxoguanine (8-oxoG), a potentially mutagenic DNA lesion, is considered to be a sensitive biomarker for oxidative stress. Another approach consists in assessing the repair capacity towards 8-oxoG, mediated predominantly by the human 8-oxoguanine DNA glycosylase 1 (hOGG1). With respect to the latter, during the last few years so-called cleavage assays have been described, investigating the incision of 32P-labeled and 8-oxoG damaged oligonucleotides by cell extracts prepared from human lymphocytes. Since for large scale epidemiological studies non-radioactive assays are preferable, the aim of this study consisted in the establishment of a test system based on a fluorescence-labelled oligonucleotide. Different oligonucleotide structures, cell extraction protocols and reaction buffers have been compared and all reaction conditions, including the amounts of oligonucleotide and cell extract as well as the reaction time have been optimized. For investigating the DNA repair capacity towards 8-oxoG the incision activities of lymphocyte extracts obtained from different donors have been investigated and inter-individual differences have been observed. Furthermore, this test system was applied to investigate the impact of cadmium and copper on the activity of isolated hOGG1 and APE1, hOGG and APE activity in cell extracts as well as in intact cells. Cadmium and copper have been shown previously to interfere with base excision repair, raising the question of molecular mechanisms. While isolated APE1 appeared to be very resistant to an incubation with cadmium or copper, a distinct inhibition of isolated hOGG1 at much lower concentrations was observed. Direct treatments of cell extracts with Cd(II) or Cu(II) confirmed these results. Incubations of intact cells with Cu(II) or Cd(II) resulted in an inhibition of hOGG activity, which was not due to an inhibition of gene expression, while even at cytotoxic concentrations no inhibition of APE activity could be detected. In conclusion, a non-radioactive cleavage assay has been established successfully, which allows to determine DNA repair capacities of different individuals towards 8-oxoG very sensitively and furthermore provides the opportunity to perform functional studies of hOGG1 and APE1 at different levels.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-24041
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2579
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2282
Exam Date: 16-Oct-2009
Issue Date: 4-Nov-2009
Date Available: 4-Nov-2009
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Basenexzisionsreparatur
Cadmium
DNA-Reparaturkapazität
Kupfer
Base excision repair
Cadmium
Copper
DNA repair capacity
Usage rights: Terms of German Copyright Law
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