Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2293
Main Title: Analysis of AU-rich Elements in the Yeast Pichia pastoris
Translated Title: Analyse von AU-reichen Elementen in der Hefe Pichia pastoris
Author(s): Lautz, Thomas
Advisor(s): Lang, Christine
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Die strenge Regulation von mRNA Stabilität und Translation durch spezifische “cis-acting“-Sequenzen und „trans-acting“-Faktoren ist für die Kontrolle der Genexpression ein essentielles Mittel. Diese Prozesse erlauben es der Zelle, das Expressionsmuster von regulatorischen Faktoren als transiente Antwort auf interne oder externe Signale wie Zellproliferation, Signaltransduktion, inflammatorische Stimuli oder (UV)-Strahlung einzustellen. Eine heute gut untersuchte „cis-acting“-Sequenz, die die mRNA-Stabilität kontrolliert, ist das „AU reiche Element“ oder „AU rich element“ (ARE), das in der 3’ untranslatierten Region (3’ UTR) von vielen, aber nicht allen, instabilen mRNAs von verschiedenen Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Protooncogenen und Transkriptionsfakotren zu finden ist. Es wurde ein heterologes System für die Analyse von AREs in der Hefe P. pastoris etabiliert. Die zwei AREs des humanen Protoonkogen c-fos und des Cytokins TNF wurden in die 3’ UTR von P. pastoris Expressionsvektoren kloniert. Es wurde gezeigt, dass beide AREs in dieser Hefe Funktionalität besitzen und verschiedenartig reguliert werden. Dieses Ergebnis betont zusätzlich die Konservierung des ARE-regulierten Systems unter Eukaryonten und unterstreicht seine Wichtigkeit im zellulären Zusammenhang. Eine Auswahl von verschiedenen Reporterkonstrukten sowie Mutationsanalysen zeigten die Wichtigkeit zweier spezieller mRNA Hairpins, die einen signifikanten Einfluss auf Transkriptstabilität und Translation haben können. Damit konnte die Involvierung von ARE-flankierenden Sequenzen und Strukturen bei dem ARE-regulierten mRNA-Umsatz und sehr wahrscheinlich bei der Selektion von ARE-Bindungsproteinen (ARE-BP). Schließlich konnte ein Modell aufgestellt werden, das die beobachteten Effekte abhängig von der mRNA Sekundärstruktur erklärt. Um weitere für dieses Modell unterstützende Daten zu sammeln und um endogene ARE-BPs zu identifizieren, wurden Gelretardationsassays durchgeführt. Es konnte ein ca. 14 kDa großes Protein als Bindungspartner für die c-fos als auch TNF ARE Sequenzen identifizert werden.
The tight regulation of mRNA stability and translation by specific cis-acting sequences and trans-acting factors is an essential means for the control of gene expression. These processes allow cells to rapidly adjust the expression pattern of regulatory factors and response transiently to internal and external signals including cell proliferation, signal transduction, inflammatory stimuli and radiation. A well known important cis-acting sequence element that controls mRNA stability is the AU-rich element (ARE) found in the 3’ untranslated region (3’UTR) of many, but not all, unstable mRNAs of various growth factors, cytokines, proto-oncogenes and transcription factors. A heterologous system for the analysis of AREs in the yeast Pichia pastoris was established. The AREs from the human proto-oncogene c-fos and the cytokine TNF were separately cloned into the 3’ UTR of P. pastoris expression vectors. It was demonstrated that both AREs are functional in this yeast and that they are regulated in different ways. This finding further stresses that the ARE-regulated system is conserved among eukaryotes and it underlines the importance of the system in the cellular context. A set of reporter constructs and mutational analysis were used to, analyse the importance of two special hairpins, which we hypothesize to have significant influence on transcript stability and translation. Thus, evidence is provided for the involvement of ARE-flanking sequences in ARE-mediated mRNA turnover and most likely in the selectivity of RNA-binding proteins. Finally, a model is proposed that explains the observed effects on protein and mRNA level in a RNA-structure-dependent manner. In order to find further support for the findings and to identify ARE-BPs gel retardation assays were performed. As a result an approximately 14 kDa protein could be identified as a binding partner of the core c-fos and TNF AREs in Pichia.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-17340
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2590
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2293
Exam Date: 11-Dec-2007
Issue Date: 18-Nov-2009
Date Available: 18-Nov-2009
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): AU-reich
MRNA-Struktur
Pichia
Transkriptstabilität
Translation
AU-rich
MRNA-structure
Pichia
Transcriptstability
Translation
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