Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2418
Main Title: Alternative Methoden für den Nukleinsäure-basierten Nachweis genetisch veränderter Lebens- und Futtermittel
Translated Title: Alternative Methods for Nucleic Acid Based Detection of Genetically Modified Foods and Feeds
Author(s): Roth, Lillian
Advisor(s): Kroh, Lothar W.
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: In der vorliegenden Arbeit wird die Untersuchung neuer methodischer Ansätze für die Analyse genetisch veränderter Organismen (GVO) in Lebens- und Futtermitteln beschrieben. Der Bedarf für die Entwicklung alternativer GVO-Nachweismethoden ergibt sich aus den Rechtsvorschriften bezüg¬lich der Rückverfolgbarkeit von GVO in der Europäischen Union sowie der fortschreitenden Zu¬nahme von GVO in Europa. Die durchgeführten Arbeiten hatten grundsätzlich zwei Schwerpunkte. Einerseits wurde ein Verfahren der Gesamtgenomamplifikation, die multiple displacement amplification, für die An¬reicherung von Proben-DNA eingesetzt und hinsichtlich ihrer Eignung für die GVO-Analyse unter¬sucht. Genomische DNA verschiedener genetisch veränderter Maislinien wurde mit dieser Methode amplifiziert. Die resultierende DNA wurde hinsichtlich ihrer Ausbeute und Qualität beurteilt. In Real-Time PCR (Polymerasekettenreaktion)-Analysen wurde das Verhalten der ampli¬fizierten DNA mit dem der Ausgangs-DNA verglichen. Zudem wurde die Gleichmäßigkeit der Ver¬viel¬fältigung verschiedener Genom-Abschnitte geprüft. Unabhängig von der Menge eingesetzter genomischer DNA wurde eine konstante Ausbeute hochmolekularer Mais-DNA generiert, die sich in der Real-Time PCR identisch zur Ausgangs-DNA verhielt. Die Amplifikation verschiedener Genom¬abschnitte war weitgehend gleichmäßig. Die mittels multiple displacement amplification vervielfachte DNA ist für die qualitative GVO-Analyse geeignet und kann zur Anreicherung von Proben-DNA oder als Referenzmaterial ver¬wendet werden. Das zweite Teilziel der Arbeit war die Entwicklung eines DNA-Nachweisverfahrens für die parallele GVO-Detektion als Alternative zur PCR. Die Methodik sollte auf den Ergebnissen des ersten Teils aufbauen, indem die Gesamtgenomamplifikation als Grundlage für die Bereitstellung von Proben-DNA genutzt werden sollte. Es wurde eine neue Strategie für die Sequenz-spezifische DNA-Detektion entwickelt, bei der eine Kombination aus direkter Hybridisierung genomischer DNA, immunologischer Detektion und Signal-Amplifikation mittels einer uniformen PCR ein¬gesetzt wird. Die Detektion und Visualisierung basiert auf dem Prinzip der aus dem Bereich der Protein-Analytik stammenden Real-Time Immuno-PCR. Nach dem Aufbau einer geeigneten Methodik und der Optimierung einzelner Arbeitsschritte wurde die Leistungsfähigkeit der Methode für die Detektion ver¬schiedener Zielmoleküle untersucht. Die Ergebnisse belegen erstmals den Sequenz-spezifischen, selektiven Nachweis von DNA mit der Real-Time Immuno-PCR, die bisher ausschließlich für den Nachweis von Antigenen verwendet wurde. Sowohl synthetische Oligo¬nukleotide als auch PCR-ampli¬fizierte Proben-DNA ließen sich mit und ohne Anwesenheit von Hintergrund-DNA mit hoher Messpräzision und Wiederholbarkeit nachweisen. Die Nachweis¬grenze für ein synthetisches DNA-Oligomer unter optimierten Nachweisbedingungen lag bei 6 Attomol, während PCR-ampli¬fizierte DNA in Mischungen mit nicht-komplementären PCR-Amplika bis zu einer Menge von 60 Attomol detektiert wurde. Die hohe Signalstärke der Detektion durch die Signal-Amplifikation mittels PCR war gleichzeitig mit starken Hintergrund-Signalen verbunden, die die Sensitivität der DNA-Detektion in Anwesenheit größerer Mengen unspezifischer DNA verringerten. Versuche mit genomischer Hintergrund-DNA zeigten, dass die Sensitivität der Detektion nicht für den direkten Nach¬weis von Einzelkopie-Sequenzen in komplexer genomischer DNA – wie genetisch veränderter Pflanzen-DNA – ohne eine vorherige Zielsequenz-Amplifikation ausreicht. Ein Einsatz der Methode für andere An¬wendungen ist denkbar, bei denen entweder kleinere Genome (beispielsweise von Bakterien oder Viren) oder mehr¬fach im Genom vorhandene Zielsequenzen untersucht werden.
The present thesis explores novel approaches for the analysis of genetically modified organisms (GMOs) in foods and feeds. The European legislation related to traceability of GMOs and the constantly increasing number of GMOs in Europe create a demand for the development of alternative GMO detection methods. The focus of this work is on two objectives. On the one hand, multiple displacement amplification, a whole genome amplification technique, was tested for its suitability regarding the enrichment of sample DNA for GMO analysis. Genomic DNA of several genetically modified maize lines was amplified and evaluated in terms of yield and quality. The real-time PCR (polymerase chain reaction) properties of the amplified DNA were assessed in comparison with the original DNA. Additionally, gene representation after multiple displacement amplification was analyzed with respect to a possible amplification bias. Regardless of the amount of input DNA, amplification yielded a constant amount of high molecular weight maize DNA. Real-time PCR performance and gene representation of the amplified DNA were comparable to those of the original DNA. Multiple displacement amplification is a suitable tool for the accumulation of sample DNA and the generation of reference material for qualitative GMO analysis. The second intention of this study was the design and development of a DNA detection method for the parallel detection of GMOs as an alternative to PCR. The approach was to be based on the results of the first part of this work by using the multiple displacement amplification technique for the preparation of sample DNA. A novel strategy for sequence specific DNA detection was developed, applying a combination of direct hybridization of genomic DNA, immunological detection and signal amplification by a uniform PCR. Visualization relies on the principle of real-time immuno-PCR, a technique formerly used for protein detection. A methodological concept was implemented and several experimental steps were optimized. Subsequently, the performance of the method was determined concerning the detection of various target molecules. The obtained results demonstrate for the first time a sequence specific and selective detection of DNA by the real-time immuno-PCR technique. Both synthetic oligonucleotides and PCR amplified sample DNA with or without the presence of background DNA were detected with high precision and repeatability. Under optimized conditions, the limit of detection was 6 attomol for a synthetic DNA oligomer and 60 attomol for a PCR amplified target mixed with non-complementary PCR products. The ampli¬fication power of the PCR resulted in high signal intensities. However, it was coupled with high background signals as well, thereby decreasing the sensitivity of DNA detection in the presence of major amounts of unspecific DNA. When genomic DNA background was included in the reaction, sensitivity proved not to be sufficient for the direct detection of single copy genes in complex genomic DNA – like genetically modified plant DNA – without prior target amplification. Possibly, the method might be employed for other applications than GMO detection, where either less complex genomes or multiple copy genes are analyzed.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-26089
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2715
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2418
Exam Date: 4-Dec-2009
Issue Date: 31-Mar-2010
Date Available: 31-Mar-2010
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): GVO
Lebensmittel
Multiple Displacement Amplification
Real-Time Immuno-PCR
Food
GMO
Multiple Displacement Amplification
Real-Time Immuno PCR
Creative Commons License: https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.0/
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