Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2621
Main Title: Proteomische Methoden zur Charakterisierung von phosphorylierungsvermittelten Wechselwirkungen des Adapterproteins ADAP
Translated Title: Proteomic methods for characterization of phosphorylation-mediated interactions of the adapter protein ADAP
Author(s): Lange, Sabine
Advisor(s): Stahl, Ulf
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Eine Vielzahl von Protein-Protein-Wechselwirkungen, die eine wichtige Rolle in Signaltransduktionsprozessen spielen, wird über Wechselwirkungen mit relativ kurzen Peptidsequenzen vermittelt, wobei vor allem über posttranslational modifizierte Proteinsequenzen Bindungen ausgelöst bzw. unterbunden werden können. So findet z.B. eine exakte Regulation wichtiger zellulärer Signalwege über reversible Proteinphosphorylierungen statt. In der vorliegenden Arbeit wurden differentielle Peptid-Protein-Interaktionsexperimente (Pulldown-Experimente) mit phosphorylierten und den korrespondierenden unphosphorylierten Peptiden durchgeführt, um phosphorylierungsspezifische Interaktionspartner des Adapterproteins ADAP, welches entscheidende Funktionen im T-Zellsignalweg als Teil der adaptiven Immunantwort einnimmt, zu bestimmen. Dazu wurden Peptidsequenzen, welche die Tyrosine 595, 625 sowie 771 der ADAP-Sequenz abdeckten, mittels Festphasenpeptidsynthese synthetisiert, aufgereinigt und kovalent an Agarose gebunden. Die Konjugate zeigten vergleichbare Beladungen mit phosphorylierten und unphosphorylierten Peptiden im Bereich von 18-40 nmol Peptid/mg Agarose, sowie eine reproduzierbare phosphorylierungsspezifische Bindung der SH2-Domäne der Tyrosin-Proteinkinase Fyn. Die Bestimmung der phosphorylierungsspezifisch interagierenden Proteine mit den ADAP-Peptiden aus Jurkat-T-Zelllysat erfolgte über quantitative Massenspektrometrie unter Verwendung von Markierungsverfahren mit stabilen Isotopen. Dafür wurden zwei Methoden eingesetzt: die Markierung von einzelnen Aminosäuren in Zellkultur (stable isotope labeling by amino acids in cell culture [SILAC]) und die enzymatische 18O-Markierung mit schwerem Wasser. An allen untersuchten Peptidsequenzen konnten phosphorylierungsabhängige Wechselwirkungen von mehr als zehn Proteinen gezeigt werden. Dabei wurden die Proteine CRK, NCK1/2, PIK3R1, PLCγ1 und SLP76 von allen drei Phosphotyrosinpeptiden gleichermaßen rekrutiert. Andererseits zeigte sich auch sequenzspezifisches Bindungsverhalten, da z.B. das Ras GTPase aktivierende Protein RASA1 nur mit der ADAP-595-Sequenz interagierte. Sowohl bekannte SH2-Domänen-basierte Wechselwirkungen von ADAP mit SLP76, als auch neue Interaktionspartner die im Kontext des T-Zellrezeptor-Komplexes beschrieben werden, wie z.B. das Protein RASA1, konnten identifiziert werden. Der Vergleich beider Quantifizierungsmethoden zeigte eine gute Übereinstimmung der Ergebnisse. Alle mit der SILAC-Methode identifizierten Proteine, die mit ADAP-595 und ADAP-771 interagierten, wurden auch mit der 18O-Methode identifiziert. Am Tyr 625 wurden zusätzlich zu den neun phosphorylierungsspezifisch bindenden Proteinen, die mit beiden Methoden bestimmt wurden, zwei Bindungspartner ausschließlich mit der SILAC-Methode und vier Proteine ausschließlich über die 18O-Markierung identifiziert. Eines der interagierenden Proteine, die nicht mit der SILAC-Methode bestätigt werden konnten, war beispielsweise die Tyrosin-Proteinkinase Fyn. Diese ist bekannt für ihre Wechselwirkung mit dem phosphorylierten Tyr 625. Die Interaktion konnte jedoch mit der 18O-Methode bestätigt werden. Obwohl mit dieser Methode keine Unterscheidung zwischen direkten oder indirekten Wechselwirkungen vorgenommen werden kann, zeigt die Tatsache, dass alle über das Peptid-Pulldown-Verfahren identifizierten potentiellen Bindungspartner SH2-Domänen enthalten und auch bekannte Adapterproteine und Kinasen in der T-Zellrezeptor-Signalweiterleitung sind, die Relevanz der detektierten Wechselwirkungen für die adaptive Immunantwort. Weiterhin wurden Peptid-Pulldown-Experimente mit Phosphotyrosinanaloga durchgeführt. Dafür wurden Peptid-Phosphonate und –Phosphoramidate der ADAP-595-Sequenz eingesetzt. Es zeigte sich, dass beide Analoga ähnliche Bindungseigenschaften wie die Phosphotyrosin-Peptide aufweisen, jedoch sind für weiterführende (biologische) Experimente Optimierungsschritte der Interaktionsbedingungen und die Charakterisierung der Bindungsparameter zwingend notwendig.
A high number of protein-protein-interactions which play key roles in signal transduction processes are mediated by small peptide sequences of the proteins. Especially posttranslational modifications lead to stable binding of proteins, e.g. the reversible process of phosphorylation of proteins regulates crucial cellular pathways in a very precise manner. Here, peptide interaction experiments (pulldown experiments) with phosphorylated and the corresponding unphosphorylated peptides were used to identify potential phosphospecific binding partners of the protein ADAP. This adapter protein performs key functions in the T cell receptor (TCR) signaling process as a part of the adaptive immune system. Peptide sequences covering tyrosines 595, 625 and 771 of ADAP were synthesized using solid-phase peptide synthesis, purified and covalently coupled to agarose beads. Characterization of the resulting peptide constructs showed a loading of 18-40 nmol peptide per mg agarose with similar values for the corresponding (phosphorylated/unphosphorylated) sequences. The phosphospecific interaction of the peptide constructs with the expressed SH2 domain of the tyrosine phosphokinase Fyn confirmed the biological activity of the constructs. For the identification of phosphospecific binding partners of the ADAP peptides, Jurkat T cell lysate was used in combination with quantitative mass spectrometry and two stable isotope methods: stable isotope labeling by amino acids in cell culture [SILAC] and enzymatic 18O-labeling with heavy water during tryptic digestion. All analyzed peptide sequences recruited more than ten phosphospecific binding partners. The proteins CRK, NCK1/2, PIK3R1, PLCγ1, and SLP76 interact phosphospecifically with each sequence in a similar way. Apart from that, the peptide pulldown method allows to distinguish sequence-specific binding, e.g. the protein RASA1 showed exclusive binding to phosphorylated ADAP-595. In addition to previously known SH2 domain-based interactions of ADAP with SLP76, novel ADAP interaction partners were identified which belong to the larger TCR proximal signaling complex, e.g. the Ras GTPase activating protein RASA1. Comparing both quantification methods, an adequate correlation of the phosphospecific binding proteins was observed. All proteins interacting with ADAP-595 and ADAP-771 in a phosphospecific manner were identified with both methods. To ADAP-625, nine phosphospecific binding proteins were identified with both methods, whereas two or four proteins were identified with only SILAC or 18O-labeling, respectively. Interestingly, the tyrosine phosphokinase Fyn, which is a reported phosphospecific binding protein to ADAP-625, was only identified with the 18O-labeling while the SILAC approach did not show phosphospecific interaction. Although, no differentiation of direct or indirect binding proteins of ADAP is possible using the peptide pulldown method, the fact that most of the proteins are SH2-domain-containing proteins which are reported to play a key role in the larger TCR proximal signaling complex shows the relevance of the detected interactions in regard to the adaptive immune response. Another application of the peptide pulldowns was accomplished by using phosphoanalogous structures: phosphonate and phosphoramidate of the sequence ADAP-595. It was found that both analogs showed binding properties similar to the naturally occurring phosphorylation. Yet, an optimization of the protocol in combination with a further characterization of the binding parameters is indispensable.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-28280
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/2918
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2621
Exam Date: 6-Oct-2010
Issue Date: 3-Nov-2010
Date Available: 3-Nov-2010
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): 18O-Markierung
ADAP
Peptid-Protein-Wechselwirkungen
Quantitative Massenspektrometrie
SILAC
18O-labeling
ADAP
Peptide protein interactions
Quantitative mass spectrometry
SILAC
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