Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2872
Main Title: Untersuchungen zur Bildung von Sekundärmetaboliten und extrazellulären Enzymen bei Eisenbakterien mittels (molekular)biologischer und chemischer Screeningverfahren
Translated Title: Investigations of the production of secondary metabolite and extracellular enzymes by iron bacteria using molecular (biological) and chemical screening methods
Author(s): Alramo, Abir
Advisor(s): Szewzyk, Ulrich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Im Rahmen dieser Arbeit wurden über 70 verschiedene Eisenbakterien, die aus eisenhaltigen Gewässern im Nationalpark Unteres Odertal und in Feuerland für unsere AG von Bertram Schmidt isoliert wurden, auf die Synthese von Sekundärmetaboliten und auf extrazelluläre Enzymaktivitäten untersucht. Untersucht wurden insbesondere Vertreter der Sphaerotilus-Leptothrix-Gruppe, der Actinobacteria-Gruppe und ein Stamm aus dem Phylum Chloroflexi. Da diese Organismen in ihrer Morphologie, ihrem Lebenszyklus und ihrem Energiestoffwechsel über viele Besonderheiten verfügen, wurden sie für eine Suche nach Sekundärmetaboliten eingesetzt. Mit einer Kombination von biologischen, chemischen und molekularbiologischen Screeningverfahren wurde eine breit angelegte Suche nach potentiellen Sekundärstoffproduzenten durchgeführt. Ein biologisches Screening mittels Agardiffusionsassay sollte biologisch aktive Stoffe nachweisen. Dabei zeigten nur Extrakte einiger Kineosporia-Stämme antagonistische Wirkung gegenüber zwei Pilzen, während die Extrakte aller anderen Stämme keine Aktivitäten aufwiesen, obwohl sie aufgrund der Daten der 16 S rDNA-Sequenzierung mit den Wirkstoffproduzenten sehr nah verwandt sind. Bei dem chemischen Screening wurde ein Teil der Bakterien auf ihr Metabolitenspektrum mittels LC-MS und NMR hin untersucht. Es zeigte sich, dass viele der untersuchten Rohextrakte unauffällig waren und es konnten bei vielen Stämmen auch bei Variation der Kulturbedingungen Sekundärmetabolite nicht eindeutig nachgewiesen werden. Nur Extrakte aus Kineosporia-Stämmen zeigten ein interessantes Metabolitenprofil, da sie Signale im aromatischen Bereich aufwiesen, die nicht aus dem Kulturmedium stammten. Das Metabolitenspektrum wird in laufenden Untersuchungen durch eine Fraktionierung ihrer Extrakte noch eingehender untersucht. Signale im aromatischen Bereich wurden nur beobachtet, wenn Kineosporia-Stämme in Sojamehl-Mannit-Medien als Flüssigkulturen kultiviert wurden, bei Oberflächenkulturen auf demselben Medium traten sie nicht auf. Durch den Einsatz unterschiedlicher Medien wurde in dieser Arbeit der Einfluss der Medienzusammensetzung auf die Produktion von Sekundärmetaboliten untersucht, mit dem Ziel, möglichst geeignete Bedingungen für die Produktion interessanter Sekundärmetabolite zu finden. Hierbei erwies sich das SM-Medium als am besten geeignet. Die Suche nach Sekundärmetaboliten mittels MALDI-TOF-MS Analyse von Kulturextrakten lieferte keine verwertbaren Aussagen, da in den vorhandenen Datenbanken keine Informationen über Referenzspektren für den Vergleich mit den aufgefundenen dominierenden Peaks zur Verfügung standen. Ein Teil der Bakterien wurde auf die Bildung von Acyl-Homoserinlaktonen (AHL) durch den Einsatz verschiedener AHL-Indikatorstämmen untersucht, um zu prüfen, ob dieser Typ von Signalmolekülen für die intraspezifische Kommunikation genutzt wird. Hier zeigten nur Pseudomonaden positive Ergebnisse. Anscheinend spielen die AHL bei den anderen untersuchten Bakteriengruppen keine Rolle und die Kommunikation erfolgt bei ihnen möglicherweise durch andere Mechanismen oder es kann durch die eingesetzten Indikatorstämme nicht detektiert werden. Des Weiteren wurde die Fähigkeit zur Bildung von Sekundärmetaboliten auf genetischer Ebene untersucht, wobei spezifische Primer zum Nachweis von Genen des Sekundärstoffwechsels (PKS und NRPS) eingesetzt wurden. Dabei konnten insbesondere bei allen Tetrasphaera-Stämmen NRPS-Gene nachgewiesen werden. Da das chemische Screening für diese Stämme aber keine interessanten Befunde erbrachte, sollten weitere Untersuchungen zur Optimierung der Kulturbedingungen nach dem OSMAC-Konzept für eine maximale Expression der Gene durchgeführt werden.
In the course of this work more than 70 different strains of iron-bacteria, which had been isolated for our working group by Bertram Schmidt from iron containing waters of the National Park Unteres Odertal and from Tierra del Fuego, were examined in respect of the synthesis of secondary metabolites and the activity of extracellular enzymes. The analysis was focused in particular on members of the Sphaerotilus-Leptothrix group, the Actinobacteria group and on one strain from the phylum Chloroflexi. These organisms were chosen in order to search for secondary metabolites because they exhibit many special features with regard to morphology, lifecycle and energy metabolism. A broad investigation was performed using a combination of biological, chemical and molecularbiological screening methods for potential producers of secondary metabolites. The agar diffusion assay was used as a biological screening method in order to detect biologically active compounds. As a result only the extracts from some Kineosporia strains had an antagonistic effect towards two species of fungi. The extracts from all other strains showed no activity, although according to the data from 16 S rDNA sequencing they were closely related to the producers of the antimicrobials. The chemical screening for the spectrum of metabolites by means of LC-MS and NMR was applied to a fraction of the bacterial strains. It turned out that many of the crude extracts were not conspicuous and for many strains there was no clear evidence for secondary metabolites, even when they were cultivated under different conditions. Only the extracts from strains of Kineosporia had an interesting profile of metabolites, exhibiting signals in the aromatic region, which did not arise from the culture medium. Currently the spectra of metabolites are examined in more detail by fractionation of these extracts. Signals from aromatic compounds only appeared when strains of Kineosporia were grown on soy-mannitol medium in liquid culture. They were absent in surface-cultures of the same medium. In order to find the most appropiate conditions for the production of interesting secondary metabolites, the influence of the composition of the media on the production was examined by using different media. The best results were obtained with SM-medium. The search for secondary metabolites by MALDI-TOF-MS analysis of extracts from cultures provided no useful information due to the lack of reference spectra for the dominating peaks in available data bases. Some of the bacterial strains were tested for the production of N-Acyl homoserine lactones (AHL) by the use of AHL indicator strains in order to examine if this type of signal molecules is used for intraspecific communication. Positive results were found only for pseudomonads. It seems as if AHLs do not play any role in the other bacterial groups examined and that the communication possibly takes place by other mechanisms or they cannot be detected by the used test strains. Furthermore the ability to produce secondary metabolites was examined on the level of genetics, by the use of specific primers for genes involved in secondary metabolism (PKS and NRPS). As a result, the presence of NRPS-genes could be shown especially for all strains of Tetrasphaera. But as the chemical screening of these strains did not yield any interesting data, further tests should be conducted in order to optimize the culture condiditions according to the OSMAC concept to achieve maximal gene expression.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-31366
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3169
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2872
Exam Date: 6-Jun-2011
Issue Date: 28-Jun-2011
Date Available: 28-Jun-2011
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Eisenbakterien
Exoenzyme
Screeningverfahren
Sekundärmetabolite
Exoenzymes
Iron bacteria
Screening methods
Secondary metabolite
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