Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2889
Main Title: Identifizierung, Bereitstellung und Charakterisierung von Pseudomonas Lipasen zur kinetischen Racemattrennung von α-Hydroxyketonen
Translated Title: Identification, preparation and characterization of Pseudomonas lipases to perform the kinetic resolution of α-hydroxy ketones
Author(s): Maraite, Andy
Advisor(s): Ansorge-Schumacher, Marion
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Im Feinchemiesektor sowie in der pharmazeutischen Industrie stellen chirale α Hydroxyketone wertvolle Grundbausteine dar. Daher wurden eine Reihe chemischer asymmetrischer Synthesen entwickelt, die jedoch allesamt ziemlich ineffizient sind, da aufgrund mehrerer Syntheseschritte unerwünschte Nebenprodukte und eine geringe Gesamtausbeute anfallen. Zudem ist die Enantiomerenreinheit eher gering. So wurden verschiedene biokatalytische Strategien entwickelt, da Enzyme aufgrund ihrer hohen Chemo-, Regio- und Enantioselektivitäten die Probleme der rein chemischen Synthese umgehen können. Zudem sind sie auch bei milden Reaktionsbedingungen einsetzbar. Als industriell wichtigste Methode zur Gewinnung enantiomerenreiner α-Hydroxyketone hat sich die kinetische Racemattrennung durch Hydrolasen durchgesetzt, da diese Enzyme keine Cofaktoren benötigen und sich als relativ stabil und aktiv in organischen Lösungsmitteln erwiesen haben. So katalysiert die Lipase TL aus Pseudomonas stutzeri die kinetische Racemattrennung von Benzoin als Modellsubstrat für α-Hydroxyketone. Die eingesetzte Lipase ist ein kommerzielles Präparat, über dessen Natur bisher sehr wenig bekannt ist. Ziel der Arbeit war die Identifikation der Lipase TL mit anschließender Expression, Aufreinigung und biochemischer Charakterisierung. Zudem sollte die Fähigkeit des rekombinanten Enzyms zur kinetischen Racemattrennung von α-Hydroxyketonen untersucht werden. Die Aminosäuresequenz und Struktur der Lipase, LipC genannt, konnten aufgeklärt werden. Zudem wurde eine hohe Homologie zur LipA aus P. aeruginosa festgestellt. Des Weiteren wurde das P. stutzeri Genom auf weitere Lipasen der gleichen Größenordnung untersucht. Dabei wurde die Lipase LipD entdeckt, die eine hohe Homologie gegenüber der P. mendocina Lipase 2FX5 (PDB) aufweist. Modellierungsversuche am aktiven Zentrum durch unseren Kooperationspartner in Madrid ergaben, dass theoretisch sowohl die LipC als auch die LipD in der Lage sein sollten, die KR von α-Hydroxyketonen zu katalysieren. Beide Enzyme wurden rekombinant in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Die LipC benötigte zur korrekten Faltung ein spezifisches Chaperon (LipH), das zusammen mit der LipC co-exprimiert wurde. Die LipA aus P. aeruginosa wurde bisher nur als natives Enzym aus dem Wildtypstamm isoliert. Die Arbeitsgruppe Rosenau-Jaeger hat ein rekombinantes Expressionssystem in E. coli für die LipA entwickelt und zur Verfügung gestellt. Somit konnten die rekombinanten Enzyme LipA, LipC und LipD biochemisch charakterisiert und auf die Fähigkeit zur kinetischen Racemattrennung von α-Hydroxyketonen untersucht werden. Die Enzyme LipA und LipC waren in der Lage die KR von Benzoin zu katalysieren, allerdings mit einer geringeren Aktivität gegenüber der Lipase TL. Grund der Aktivitätsunterschiede liegt vermutlich in der mangelhaften Disulfidbrückenbindung der Lipasen während der heterologen cytoplasmatischen Expression in E. coli. Die LipD war nicht in der Lage, die KR von Benzoin zu katalysieren, allerdings konnte α-Methylbenzylbutyrat umgesetzt werden. Somit konnte gezeigt werden, dass ein aromatischer Ligand am sekundären Alkohol nicht den limitierenden Faktor darstellt, sondern viel mehr die Benzoylgruppe der α-Hydroxyketone.
In fine chemistry sector as well as pharmaceutical industry chiral α-hydroxy ketones presents valuable building blocks. Therefore several chemical approaches were developed to synthesise these compounds, but they’re all together rather inefficient. The synthesis often requires many steps resulting in increased waste production combined with low yields. Furthermore enantioselectivities are usually low. So several biocatalytic strategies were developed because enzymes may overcome these problems as a result of their high regio-, chemo- and enantioselectivities. Furthermore they are applicable at mild reaction conditions. The dominant production method in industry to obtain enantiopure α-hydroxy ketones presents the kinetic resolution (KR) of racemates catalysed by hydrolases. These enzymes don’t need any cofactors and are relatively stable and active in organic solvents. So lipase TL from Pseudomonas stutzeri catalyses the kinetic resolution of benzoin, used as model substrate of α-hydroxy ketones. The enzyme is commercially available, but very less is known about the nature of this lipase. Goal of this study was the identification of lipase TL, with subsequent expression, purification and biochemical characterization. Furthermore the recombinant enzyme should be analysed on its ability to perform the kinetic resolution of α-hydroxy ketones. The amino acid sequence and structure of the lipase, called lipC, were determined and revealed high homology to lipA from P. aeruginosa PAO1. In addition the genome of P. stutzeri A1501 was analysed and another lipase, called lipD, in the same range of size was found. This lipase showed high homology towards P. mendocina lipase 2FX5 (PDB). Substrate modelling, performed by our co-operation partner in Madrid, revealed that both lipases (lipC such as lipD) should be able to perform the kinetic resolution of α-hydroxy ketones. Both enzymes were expressed heterologous in E. coli and purified. LipC required a specific chaperone (lipH) for its correct folding which was co-expressed together with lipC. LipA from P. aeruginosa PAO1 only was isolated as native enzyme from the wild type strain until now. The workgroup Rosenau-Jaeger developed and provided a recombinant heterologous expression system of lipA in E. coli,so the recombinant enzymes lipA, lipC and lipD were characterized biochemically and analysed on their ability to perform the kinetic resolution of α-hydroxy ketones. LipA and LipC catalysed the KR of α-hydroxy ketones but with lower specific activity than lipase TL. A reason of this difference in activity is probably based on missing disulphide bond formation during heterologous cytoplasmic expression in E. coli. LipD was not able to perform the KR of benzoin, but could converse α-methyl benzyl butyrate. This demonstrates that the aromatic ligand of the secondary alcohol is not the limiting factor, but the benzoyl group of α-hydroxy ketones.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-31640
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3186
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2889
Exam Date: 28-Jun-2011
Issue Date: 21-Jul-2011
Date Available: 21-Jul-2011
DDC Class: 540 Chemie und zugeordnete Wissenschaften
Subject(s): Kinetische Racemattrennung
Lipase
Pseudomonas stutzeri
Α-Hydroxyketone
Kinetic resolution
Lipase
Pseudomonas stutzeri
Α-hydroxy ketones
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