Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2901
Main Title: Untersuchungen zu Struktur und Funktion des Spannungssensors und regulatorischer Domänen im Bereich des Carboxy-Terminus von Kv7.3- und Kv7.4-Kanälen
Translated Title: Structural and functional studies of the voltage sensor and regulatory domains in the carboxy terminus of Kv7.3 and Kv7.4 channels
Author(s): Lange, Wienke
Advisor(s): Friedrich, Thomas
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Die KV7-Kanäle gehören zur Familie der spannungsabhängigen Kaliumkanäle. Sie sind als langsam aktivierende Kanäle entscheidend für die Repolarisation des Membranpotentials in erregbaren Zellen des Herzens und des Nervensystems sowie an der Kaliumhomöostase z. B. im Innenohr beteiligt. Wie alle spannungsabhängigen Kaliumkanäle besitzen sie pro Untereinheit sechs Transmembrandomänen und intrazellulär lokalisierte N- und C-Termini. Der C-Terminus zeichnet sich durch eine besondere Länge im Vergleich zu anderen Kanälen aus. Er stellt ca. die Hälfte der Proteine dar und weist zwischen den fünf Isoformen der α-Untereinheiten deutliche Sequenz- und Längenunterschiede auf. Basierend auf Arbeiten von Maljevic et al. (2003), die eine Stromerhöhung bei der Substitution des C-Terminus von KV7.1 und KV7.2 durch den von KV7.3 nachgewiesen hatten, konnte ein vergleichbarer stromerhöhender Effekt durch den Austausch des CT auch auf KV7.4 übertragen werden. Die für diesen Effekt verantwortliche Sequenz wurde auf einen Bereich des Helix-A-B-Linkers von Leu-444 bis Ala-497 von KV7.3 eingeengt. In dieser Region ist eine PIP2-Bindungsstelle, ein sog. kationisches Cluster, aus basischen Aminosäuren beschrieben worden. Vermutlich verursacht eine Erhöhung der apparenten PIP2-Affinität die Stromerhöhung. Dies konnte durch den Vergleich von Koexpressionsuntersuchungen mit der spannungsabhängigen PIP2-Phosphatase Ci-VSP sowie durch Injektion des wasserlöslichen PIP2-Analogons diC8-PIP2 festgestellt werden. Die erhöhten PIP2-Affinitäten korrelieren möglicherweise mit einer gesteigerten Offenwahrscheinlichkeit, die sich als Erhöhung der Ganzzellströme bemerkbar macht. Eine Auswirkung auf die Oberflächenexpression wurde nicht detektiert. In einer Parallelstudie an KV7.1/7.3-Chimären erwies sich der Austausch der QKQ- (Q357 bis Q359 in KV7.1) durch die EQH-Sequenz (E361 bis H363 in KV7.3) als verantwortlich für einen beträchtlichen Teil der Stromerhöhung. Diese Aminosäuren liegen innerhalb einer weiteren PIP2-Bindungsstelle im Bereich der intrazellulären Porenmündung, deren Bedeutung auch in dieser Arbeit nachgewiesen wurde. Der Austausch der im KV7.4-Kanal konservierten EQH-Sequenz (E328 bis H330 in KV7.4) gegen das Aminosäuretriplett QKQ bewirkt einen Funktionsverlust des Kanals. Vermutlich ist diese Bindungsstelle essentiell für die Kanalfunktion, während das Motiv mit dem kationischen Cluster hauptsächlich modulierenden Charakter besitzt. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Cystein-Scanning-Mutagenese im Bereich des Spannungssensors von KV7.3(TD:7.1) durchgeführt. Es wurden sukzessive Cysteine im C-terminalen S3-Segment, im S3-S4-Linker und im N-terminalen S4-Segment eingeführt und deren extrazelluläre Zugänglichkeit mit dem cysteinmodifizierenden Reagenz MTSES untersucht. Es konnte eine Zugänglichkeit der Cysteine an den Aminosäurepositionen des N-terminalen Endes der S4-Domäne von A223C bis R227C nachgewiesen werden. Die Mutationen S228C und L229C waren nur bei Inkubation im aktivierten Zustand des Kanals zugänglich. Unsere Ergebnisse sprechen für eine Bewegung des S4-Segments bei Depolarisation nach außen, wobei mindestens zwei Aminosäuren, die im geschlossenen Zustand nicht exponiert sind, bei Öffnung des Kanals zugänglich werden. Cadmium-Quervernetzungsexperimente zwischen Cysteinen, die in die S4- und S3- bzw. S5-Domäne eingeführt wurden, konnten keine Nachbarschaftsbeziehung der Aminosäurepositionen validieren. Allerdings konnten Cysteine an der Position L226 (S4) benachbarter Untereinheiten quervernetzt werden. Diese Interaktion stabilisiert wahrscheinlich den offenen Zustand der Kanäle. Außerdem wurde ein Quervernetzungseffekt für Cysteine an den Positionen S225 (S4) mit endogenen Cysteinen der Position 136 (S1) nachgewiesen, der den geschlossenen Zustand der Kanäle stabilisiert. Der Austausch des endogenen Cysteins C136 gegen Alanin hebt die Inhibition der Tail-Ströme nach Cadmiumchloridzugabe auf. Stattdessen kommt es zu einer leichten Linksverschiebung der Aktivierungskurve. Zwischen Cysteinen an der Position R227 (S4) konnte ebenfalls ein Crosslinking-Effekt mit C136 nachgewiesen werden. Die vernetzten Cysteine stabilisieren die geschlossene Konformation der Kanäle. Ähnlich wie bei S225C wurde beobachtet, dass nach Substitution des endogenen C136 gegen Alanin die Aktivierungskurve durch CdCl2 verschoben wird. Sowohl für S225C als auch für R227C steht allerdings die Überprüfung anhand eines von endogenen Cysteinen C136 und C199 freien Hintergrunds aus. Diese Ergebnisse legen nahe, dass sich S4-Segmente zweier Untereinheiten im aktivierten Zustand in enger Nachbarschaft befinden. In der deaktivierten Konformation könnte S4 in der Nähe von S1 derselben oder einer benachbarten Untereinheit lokalisiert sein.
The slowly activating KV7 channels belong to the superfamily of voltage-gated potassium channels. They play important physiological roles especially in the excitability of the nervous system and the heart. The α-subunits constist of a core structure of six transmembrane domains and intracellularly located N- and C-termini. The C-termini that amount to nearly half of the protein differ markedly between the five isoforms in length and sequence. Based on the study of Maljevic and colleagues showing an increase in current amplitudes after substitution of the C-terminus of KV7.1 and KV7.2 with that of KV7.3 (Maljevic et al., 2003), we could detect a similar effect for KV7.4/ KV7.3 chimeras. The sequence of effect could be narrowed down to a motif of 54 amino acids (Leu-444 to Ala-497). This region includes a so-called cationic cluster of basic residues reported to be involved in PIP2 binding. Coexpression studies with the voltage-dependent phosphatase Ci-VSP and the injection of diC8-PIP2 indicates that the increased whole cell currents are correlated with a higher apparent affinity for PIP2. This changed PIP2 affinity might lead to a stabilization of the open conformation of the channel and thereby increases the current amplitudes. An enhanced surface expression could be excluded by the comparison of plasma membrane preparations. In an associated study, the sequence EQH (E361 to H363) of KV7.3 was identified to be important for the increase of current amplitudes in KV7.1/ KV7.3 chimeras. These residues are conserved between all KV7 channels except KV7.1 and are located in a second PIP2 binding motif directly C-terminal of the S6 segment. The exchange of these three amino acids in KV7.4 against the sequence of KV7.1 (QKQ, Q357 to Q359) induced a loss of function of the KV7.4 channel. This confirms that this PIP2 binding site is essential for the functionality of the channel. The second binding motif of the cationic cluster may have a more modulatory role. In the second part of this work we investigated the structural features of a defined region in the voltage sensor of the KV7.3(TD:7.1) channel using accessibility studies with MTSES. Therefore, we introduced 22 single cysteine mutations in the C-terminal part of S3, the S3- S4-linker and the N-terminal part of S4. The residues A223C to R227C of the S4 segment were accessible by MTSES. S228C and L229C were only accessible after incubation at 0 mV. This leads to the assumption that the S4 segment moves transversally to the plasma membrane. At least two amino acids that were not accessible in the inactivated conformation of the voltage sensor became accessible in the activated state. The crosslinking experiments of double cysteine mutants in S4 and S3 or S4 and S5 with cadmium chloride could not validate proximity predictions of our structural model. But our results show that S225 as well as R227 (S4) might be in close proximity of C136 (S1). A crosslinking of these cysteines seems to stabilize the closed conformation of the channel. The crosslinking effect has to be tested by exchange of both endogenous cysteines C136 and C199 with alanines. Two neighboring cysteines at position L226 are constrained at proximity by cadmium chloride and thereby stabilize the open state. This leads to the assumption that S4 segments of neighboring subunits come in close proximity in the activated conformation. In the closed conformation S4 and S1 of either one subunit or different subunits may be in close proximity to one another.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-31573
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3198
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2901
Exam Date: 9-Jun-2011
Issue Date: 22-Jul-2011
Date Available: 22-Jul-2011
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Carboxy-Terminus
Kv7-Kanäle
PIP2
Quervernetzung
Spannungssensor
Carboxy terminus
Crosslinking
Kv7 channels
PIP2
Voltage sensor
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