Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2913
Main Title: Paracrine stimulation of endothelial cells and mesenchymal stem cells by the mechanically loaded human fracture haematoma
Translated Title: Parakrine Stimulation von Endothelzellen und mesenchymalen Stammzellen durch mechanisch belastete humane Frakturhämatome
Author(s): Groothuis, Aline
Advisor(s): Kraft, Marc
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät V - Verkehrs- und Maschinensysteme
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Obwohl die meisten Knochenfrakturen komplikationslos verheilen, zeigen manche eine verzögerte Heilung oder Pseudoarthrose. Angiogenese wird als essentieller Prozess betrachtet, da ihre Hemmung die Heilung verzögern oder inhibieren kann. Sowohl die frühe Phase der Knochenheilung als auch die Blutgefäβbildung werden durch mechanische Stimulation angeregt, die Mechanismen sind jedoch unklar. Die Ziele dieser in vitro Studie waren erstens, zu untersuchen, wie das ganze, frische Hämatom, sowie dessen mechanische Stimulation, Endothelzellen (EC, primäre Zellen und Zelllinie) und mesenchymale Stammzellen parakrin stimuliert. Zweitens wurden die involvierten Faktoren identifiziert. Drittens wurde eine Methode zur parakrinen Stimulation der Angiogenese im Hämatom etabliert. Mit frühen Frakturhämatomen von gesunden Patienten konnte gezeigt werden, dass die Hämatome pro-angiogen auf primäre Endothelzellen und auf eine Endothelzelllinie wirken, dass dieses Potential durch mechanische Stimulation erhöht ist und mindestens 24 Stunden anhält. Hämatome setzten die Regulatoren der Angiogenese MMP-1, -2, -3, -9, TIMP-2, VEGF, TGF-β1 und Ang-1 ins konditionierte Medium (CM) frei. Durch mechanische Stimulation werden die Konzentrationen von MMP-1, -2, -9 und TIMP-2 bei allen Patienten, und VEGF bei jungen, aber nicht bei älteren Patienten oder gemischten Populationen im CM erhöht. Im Gegensatz zu den ECs, wurde das funktionelle Verhalten der MSCs nicht von den CMs beeinflusst. Drug delivery Systeme wurden getestet. Die Transfektion von MSCs wurde durch PEI beschichteten SPIONs und ein Lipofektionskit getestet, aber erfolglos. Nukleofektion wurde nicht weiterverfolgt, wegen der niedrigen Überlebensrate der MSCs. Applikation von rekombinanten VEGF ins CM hemmte die Netzwerkbildung der primären EC und der EC-Linie. Trotzdem wurde die Netzwerkbildung auch unter Hemmung von VEGFR2 reduziert. Die Netzwerkbildung wurde durch Hinzufügen von MMP-1, 1x regulierte Menge, MMP-1, 10x regulierte Menge und MMP-2, 1x regulierte Menge im CM erhöht. Frische Hämatome stimulierten die Tubebildung, und dieses Potential konnte durch Applikation von MMP-1, 10x in 1:5 verdünnten Hämatomen mit serumhaltigem (FCS) Medium erhöht werden. Das Hinzufügen in serumfreiem Medium konnte die Netzwerkbildung nicht stimulieren. Diese Studie bestätigt die parakrine, pro-angiogene Stimulation von ECs durch das humane Frakturhämatom in vitro, und dessen Erhöhung durch eine angepasste mechanische Belastung. Dies wurde durch eine erhöhte Konzentration von Regulatoren der Angiogenese begleitet, wie GFs und MMPs. Das angiogene Potential von frischen humanen Hämatomen wurde durch Hinzufügen von mechano-regulierten MMP-1 und Serum, wahrscheinlich durch Aktivierung und / oder Freisetzung eines GFs des FCS stimuliert.
While most bone fractures heal without complications, some of them develop a delayed union or pseudoarthrosis. Angiogenesis has been shown to be an essential process as its blocking delays or inhibits the bone healing process. Both the early phase of bone healing and blood vessel formation are known to respond to mechanical stimulation, however through unclear mechanisms. The aims of this in vitro study were first to investigate the paracrine stimulation by the whole, fresh haematoma and its mechanical loading, on endothelial cells (ECs, primary human cells and a cell line) and human mesenchymal stem cells (MSCs). In a second part, the factors involved were identified. Finally, a method for the paracrine stimulation of angiogenesis in the haematoma was established. By analysing early fracture haematomas of healthy patients, this study demonstrated that these haematomas are pro-angiogenic on both an EC line and primary ECs, that this proangiogenic potential is increased by mechanical stimulation, and persisted for at least 24h. Haematomas released the angiogenesis regulators MMP-1, -2, -3, -9, TIMP-2, VEGF, TGF-β1 and Ang-1 in the conditioned medium (CM). Mechanical stimulation increased the CM concentration of MMP-1, -2, -9 and TIMP-2 in all patients, as well as VEGF in young patients, but not in old patients or mixed populations. In contrast to ECs, the CMs did not significantly influence the functional behaviour of MSCs. Drug delivery systems targeting MSCs were tested. MSC transfection was tested as a delivery method for plasmid DNA, however unsuccessfully through both the PEI-coated SPIONs system and a lipofection kit. Nucleofection was inadequate due to the low survival rate of the MSCs. The application of recombinant VEGF in CM decreased tube formation on both the EC line and primary ECs. However, a VEGFR2 inhibitor also reduced the tube formation. Tube formation was enhanced by addition of recombinant MMP-1, 1x regulated concentration, MMP-1, 10x regulated concentration and MMP-2, 1x regulated concentration in the CM. Fresh haematomas stimulated the EC tube formation, and this could be increased by the supplementation of MMP-1, 10x in haematomas diluted 1:5 in medium containing foetal calf serum (FCS). The supplementations did not influence the tube formation in absence of FCS. In summary, this project confirmed the paracrine pro-angiogenic stimulation of ECs by the human fracture haematoma in vitro, and its response to an adequate mechanical stimulation. This response was accompanied by an increased concentration of angiogenesis mediators, such as GFs and MMPs. The angiogenic potential of the fresh human haematoma was increased by supplementation of the mechano-regulated MMP-1 in presence of serum, probably due to the activation and / or release of GF from the FCS.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-30705
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3210
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2913
Exam Date: 8-Apr-2011
Issue Date: 28-Jul-2011
Date Available: 28-Jul-2011
DDC Class: 620 Ingenieurwissenschaften und zugeordnete Tätigkeiten
Subject(s): Angiogenese
Frakturhämatom
Human
Mechanik
Angiogenesis
Haematoma
Human
Mechanics
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