Please use this identifier to cite or link to this item: http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2938
Main Title: Erzeugung und Charakterisierung von Mausmodellen zur Aufklärung der peripheren und zentralen gustatorischen Kommunikationsbahnen
Translated Title: Generation and characterization of mouse models to elucidate the peripheral and central gustatory pathways
Author(s): Voigt, Anja
Advisor(s): Lauster, Roland
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät III - Prozesswissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: German
Language Code: de
Abstract: Gegensätzliche Vorstellungen existieren wie Geschmacksinformation vom Mund ins Gehirn weitergeleitet, prozessiert und kodiert wird. Die Übertragung von Informationen verschiedener Geschmacksqualitäten geschieht gemäß der labeled-line Theorie auf getrennten neuronalen Bahnen, oder erfolgt gemäß der across fiber pattern Theorie durch die Aktivitätsmuster von Neuronen, die auf alle Geschmacksstimuli reagieren. Weiterhin wird auch eine temporale Kodierung diskutiert. Zur Erforschung dieser Problematik sollten im Rahmen dieser Arbeit zelluläre gustatorische Netzwerke dargestellt werden. Dazu habe ich Mauslinien erzeugt, die im Tas2r131 Bitterrezeptorlocus bzw. im Locus der spezifischen Untereinheit des Umami-rezeptors, Tas1r1, das transsynaptische Markerprotein Gerstenlektin (BL) sowie stationäre, fluoreszierende Markerproteine exprimieren. Während die Fluoreszenz-proteine die Zellen sichtbar machen, die Tas2r131 oder Tas1r1 exprimieren, findet sich das BL-Protein sowohl in diesen Zellen, als auch in solchen, die mit den Ursprungszellen in (synaptischen) Kontakt stehen. Durch RT-PCR-, in-situ-Hybridisierungs- und immunhistochemische Experimente konnte ich den erfolgreichen Knock-out beider Zielgene sowie den funktionellen Knock-in der Expressionskassetten verifizieren. Die Fluoreszenzproteine wurden erwartungsgemäß spezifisch in der Bitter- bzw. Umami-Zellpopulation oraler Geschmacksknospen exprimiert. Das BL war zusätzlich mit allen anderen untersuchten Zelltypen sowie den afferenten Fasern assoziiert, was für seinen nicht-selektiven Transfer innerhalb der Geschmacksknospen spricht. In peripheren Ganglien sowie im zentralen Nervensystem konnte das BL in Neuronen, in denen keine stationären Fluoreszenzproteine und deren mRNAs beobachtet wurden, nachgewiesen werden. Obwohl diese Ergebnisse auf einen Transfer des BLs von den Rezeptorzellen in die Nervenzellen hindeuten, sprechen die zu geringe Anzahl BL positiver Ganglienneurone und die Verteilung BL positiver zentraler Nervenzellen dagegen. Zur Aufklärung dieser Widersprüche habe ich zwei weitere Mauslinien generiert, die neben epitopmarkierten BL-Varianten die Cre-Rekombinase im Tas2r131- bzw. Tas1r1-Locus exprimieren. Die Kreuzung dieser Mäuse mit Reportermäusen führte in den Nachkommen zum sensitiven Nachweis von Tas2r131- bzw. Tas1r1-exprimierenden Neuronen. Auf diese Weise konnte erstmals eindeutig die Expression von Geschmacksrezeptoren im peripheren und zentralen Nervengewebe auf zellulärer Ebene gezeigt werden. Damit kann aufgrund der mangelnden Selektivität des BL-Transfers in der Geschmackknospe sowie der lokalen BL-Expression im Nervengewebe das vorliegende Verfahren zur Aufklärung der funktionellen Kopplung von Geschmacks-rezeptorzellen und gustatorischen Nerven als ungeeignet eingestuft werden. Die Entdeckung der Existenz von peripheren und zentralen Neuronen, die Geschmacks-rezeptoren exprimieren, war überraschend. Zur Aufklärung ihrer Bedeutung können in zukünftigen Untersuchungen die erzeugten Mausmodelle beitragen.
Contrary theories exist how taste information is transferred and processed from the oral cavity to the brain. According to the labeled line theory it is assumed that gustatory information of different taste qualities is transferred on separate neuron populations. Otherwise it is proposed by the across fibre pattern theory that taste information is transferred by a specific neuronal activation pattern involving the identical neuronal population. Moreover, a temporal coding of taste information is also under debate. To investigate these neuronal difficulties I generated mouse lines to visualize the cellular gustatory networks. These gene targeted mice express in the locus of either bitter taste receptor Tas2r131 or the umami receptor specific subunit Tas1r1 the transsynaptic marker protein barley lectin (BL) as well as a fluorescent marker protein. Thereby, cells expressing the fluorescent protein identify Tas2r131 or Tas1r1 expressing cells. However, BL protein is present in BL expressing cells and additionally in cells (synaptically) connected with the expressing cells. Using RT-PCR, in situ hybridization and immunhistochemical experiments I confirmed the successful knock out of these taste receptor genes as well as a functional knock in of the targeting cassettes. As expected, the fluorescent proteins were expressed specifically in the bitter or umami cell population within taste buds. In both models, BL associates with all taste bud cell types and with the gustatory fibres. This point to an unselective transfer of BL within taste buds. Therefore, the observed BL-labeled fibers likely received the transsynaptic marker directly from the source cell as well as indirectly following lateral diffusion preventing identification of taste-specific fibers. Moreover, the number of BL-labeled neuronal somata in the ganglia disagrees with that of connected receptor cells. In addition, although numerous neurons in various gustatory areas contain the tracer, the first order central taste neurons do not or only rarely. Even though we did not detect fluorescent cells and Tas2r131 and Tas1r1 expression by in situ hybridization outside the taste buds, we suspect that the extra-taste bud BL originates from local low level gene expression. To follow up this suspicion we engineered mice to efficiently and faithfully express BL and a red fluorescence protein from the Rosa26 locus in Tas2r131 and Tas1r1 cells. This strategy eventually identified Tas2r131 and Tas1r1 expressing cells in taste buds, the gustatory ganglia, brain stem, and various other gustatory and non-gustatory brain areas. Due to the insufficient selectivity of BL-transfer within taste buds and the local expression of taste receptors in the peripheral and central nervous system make this approach inappropriate to trace gustatory pathways reliable from type II taste receptor cells. The discovery of peripheral and central neurons expressing taste receptors was surprising. Investigations using the generated mouse lines will help to elucidate their relevancy in future projects.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-32008
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3235
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2938
Exam Date: 13-Jul-2011
Issue Date: 24-Aug-2011
Date Available: 24-Aug-2011
DDC Class: 500 Naturwissenschaften und Mathematik
Subject(s): Genetisch modifizierte Mäuse
Gerstenlektin
Geschmack
Geschmacksrezeptor
Neuronale Kodierung
Barley lectin
Gene targeted mice
Neuronal coding
Taste
Taste recepto r
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