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Main Title: MAP kinase-dependent opioid receptor expression in sensory neurons and PC2-dependent opioid peptide processing and release from immune cells
Translated Title: MAP-Kinase-abhängige Opioid-Rezeptor-Expression in sensorischen Neuronen und PC2-abhängige Opioidpeptid Procezierung und Freisetzung von Immunzellen
Author(s): Sauer, Reine Solange
Advisor(s): Süßmuth, Roderich
Granting Institution: Technische Universität Berlin, Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
Type: Doctoral Thesis
Language: English
Language Code: en
Abstract: Opioide sind für ihre zentrale analgetische Wirkung bekannt. Jedoch immer mehr Hinweise zeigen, dass Opioide auf peripheren sensorischen Neuronen analgetische Wirkung nach der Aktivierung ihrer Rezeptoren entlocken.Während der lokalen entzündlichen Schmerzen, Opioidrezeptoren zunehmend akkumulieren auf peripheren sensorischen Nervenenden und Opioid-Peptide werden durch einwandernde Immunzellen in das subkutane entzündetes Gewebe freigesetzt. Um schließlich eine starke Antinocizeption nach Freisetzung zu herstellen, müssen sie die Perineuralen Barriere von peripheren sensorischen Nerven eindringen. Diese Doktorarbeit untersucht i) ob Nervenwachstumfaktor (NGF) abhängige Signalwege verantwortlich für die erhöhte sensorische Neurone mu-Opioid-Rezeptor-Expression bei entzündlichen Schmerzen sind; ii) ob die Immunzellen endogene Opioid-Peptide Endorphin (END), enkephaline (ENK) und Dynorphin (DYN) ergeben sich aus der korrekten Prozessierung ihrer Vorläufern durch spezifische Prohormonkonvertasen und anschließlich diese Opioide freisetzen können; iii) ob exogen applizierten oder endogen freigesetzte Opioidpeptide die perineuralen Barriere von sensorischen Neuronen durchdringen und anschließend in der Lage sind, Antinozizeption unter normalen und pathologischen Bedingungen zu entlocken.In einem Tiermodell der einseitigen Hinterpfote Entzündungen nach vollständigem Freund-Adjuvans (FCA) Inokulation, i.pl. Einspritzung des vollen Opioid-Agonist Fentanyl führte zu verbesserten antinociceptive Wirkung. Lokale immunoneutralization von NGF in FCA behandelten Tieren mit einem spezifischen Antiserum oder i.pl. NGF Behandlung von naiven Tieren führte zu einer Abnahme oder Zunahme, beziehungsweise der Antinozizeption. Radioaktiv markierte Ligandenbindung mit [3H] DAMGO, Western Blot und Immunhistochemie mit einem mu-Opioid-Rezeptor (MOR) spezifische Antikörper identifiziert signifikanten Anstieg in der Anzahl der MOR-Bindungsstellen, MOR-Protein sowie MOR-immunorreactive (MOR-IR) neuronalen Zellen innerhalb Spinalganglien (DRG). Parallel dazu phosphorylierten p38-MAPK (p-p38-MAPK)-Protein und die Anzahl der p-p38-MAPK-IR Neuronen die MOR exprimieren in DRG sowie die peripher geleiteten axonale Transport von MOR deutlich erhöht.Schließlich wurden NGF-induzierte Effekte in DRG, dem axonalen Transport und der Potenzierung oder verbesserte Wirkung von Opioiden Antinozizeption durch die intrathekale Hemmung der p38-MAPK, aber nicht ERK-1/2 aufgehoben, vermutlich eine entscheidende Rolle für NGF abhängige Signalwege wie p38 MAP-Kinase. Endogene Opioid-Peptide (END, ENK und DYN) sind die Liganden der Opioid-Rezeptoren auf sensorischen Neuronen. Sie sind während stressigen Reizes ausgelöst und binden an die peripheren Opioidrezeptoren um Schmerzen zu hemmen. Doch die subzelluläre Wege der POMC, PENK und PDYN prozessierung zu END, ENK und DYN wurde noch nicht beschrieben in Entzündungszellen. Doppelte Immunfluoreszenz konfokale Mikroskopie zeigt der Kolokalisation Vorläufer Opioiden POMC, PENK oder PDYN mit ihren wichtigsten prozessierungsenzym (PC2) innerhalb subkutaner Gewebe von entzündeter Pfote. Immunhistochemie und Western Blot haben Akkumulation des Vorläufer-Proteinen POMC, PENK oder PDYN innerhalb zirkulierenden und lokalen Immunzellen von PC2-Knockout-Mäusen nachgewiesen. Entschprechend, Radioimmunoassay hat eine Abnahme der Gesamtgehalt und Formyl-Methionin-leucyl-Phenylalanin (fMLP)-induzierte Freisetzung von Opioid-Peptiden Endprodukte END, ENK und DYN von Immunzellen gemessen. Entzündliches Schmerz kann durch intraplantar Injektion oder durch endogene Sekretion Opioid-Peptide von Ratten Leukozyten im entzündeten Pfoten kontrolliert werden. Antinociception benötigt Bindung von Opioidpeptiden an Opioidrezeptoren auf peripheren sensorischen Nervenenden. In Abwesenheit von Entzündung, dringen hydrophilen Opioidpeptide die perineuralen Barriere nicht leicht durch und somit entlocken sie keine Antinozizeption. Daher war das Ziel zu untersuchen, die Bedingungen unter denen endogenen hydrophilen Opioidpeptide (dh Met-Enkephalin und Β-Endorphin) aus Neutrophilen, nozizeptive Schwellen in nichtentzündetete Gewebe bei Ratten erhöhen können. Nach intraplantar Behandlung mit hypertoner Kochsalzlösung wurde die perineuralen Barriere reversibel durchlässig für Stunden und intraplantaren Injektion von Opioid-Peptiden erhöhte mechanische nozizeptive Schwellen. Darüber hinaus führte MIP2-induzierte Rekrutierung von Leukozyten-Produzierte Opioid-Peptide in das subkutane Gewebe, ohne die Integrität des perineuralen Barriere zu beeinflussen, zu Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)-ausgelöst Opioid-Peptid-Freisetzung und die anschließende Schmerz-Hemmung. Zusammen genommen, zusätzlich zu dem Opioid-System in das zentrale Nervensystem zunehmende Beweise vermuten eine Rolle für die Opioid-System in das periphere Nervensystem. Unter der entzündlichen Schmerzen die Anzahl der Opioidrezeptoren auf peripheren sensorischen Nerven ist hochreguliert in einer NGF p38 MAPK-Kinase-Weg. In parallel Opioidpeptid-produzierende Immunzellen migrieren aus dem Blutkreislauf in unmittelbarer Nähe dieser Nerven um Opioidpeptide auf korrekte Verarbeitung aus ihren Vorläufern, um biologisch aktive Endprodukte freizusetzen. In PC2-Knockout-Mäusen dieses Opioid-Verarbeitung wurde behindert, was zu einer Akkumulation von Vorläufer und ein reduzierte Menge an Opioidpeptid Endprodukten führte. Die perineuralen Barriere, die normalerweise, dass Opioid-Peptide Zugang zu peripheren Opioidrezeptoren verhindert, ist unter entzündeten Bedingungen zerstört. Unter nicht-entzündlichen Erkrankungen des Zugangs von Opioid-Peptiden kann durch hypertone Lösungen erleichtert werden. Antinozizeption vermittelt durch endogen freigesetzte Opioidpeptide hat von daher drei wichtige Anforderungen zuerfüllen: 1) eine kritische Anzahl von Opioid-Rezeptoren im peripheren sensorischen Neuronen. 2) Opioidpeptid Expression, korrekte Prozessierung und freisetzung von Leukozyten und 3) die Eröffnung des perineuralen Barriere für Opioidpeptid Zugriff zu Opioid-Rezeptoren auf sensorische Neuronen . Dies kann für intrinsische Mechanismen der Schmerzkontrolle wichtig sein wie sich im Rahmen von Stress-vermittelte Analgesie gezeigt worden hat.
Opioids are well known for their central analgesic effects. However, growing evidence shows that opioids also elicit analgesic effects following activation of their receptors on peripheral sensory neurons. During local inflammatory pain opioid receptors increasingly accumulate on peripheral sensory nerve endings and opioid peptides are delivered by immigrating immune cells into subcutaneous inflamed tissue. To finally result in potent antinociception upon their release they have to penetrate the perineural barrier of peripheral sensory nerves. The work of this thesis examined i) whether nerve growth factor (NGF) dependent signaling pathways are responsible for the increased sensory neuron mu-opioid receptor expression during inflammatory pain; ii) whether the immune cell derived endogenous opioid peptides endorphine (END), enkephaline (ENK) and dynorphin (DYN) result from the correct processing of their precursors by specific prohormone convertases and a subsequent release; iii) whether exogenously applied or endogenously released opioid peptides penetrate the perineural barrier of sensory neurons and subsequently are able to elicit antinociception under normal and pathological conditions. In an animal model of unilateral hindpaw inflammation following Freund’s complete adjuvant (FCA) inoculation, i.pl. administration of the full opioid agonist fentanyl led to enhanced antinociceptive efficacy. Local immunoneutralization of NGF in FCA treated animals by a specific antiserum or i.pl. NGF treatment of naive animals resulted in a decrease or increase of antinociception, respectively. Radiolabeled ligand binding with [3H]DAMGO, Western blot and immunohistochemistry using a mu-opioid receptor (MOR) specific antibody identified significant increases in the number of MOR binding sites, MOR protein as well as MOR-immunorreactive (MOR-IR) neuronal cells within dorsal root ganglia (DRG). In parallel, phosphorylated p38-MAPK (p-p38-MAPK) protein and the number of p-p38-MAPK-IR neurons expressing MOR in DRG as well as the peripherally directed axonal transport of MOR significantly increased. Finally, NGF-induced effects occurring in DRG, on axonal transport and on the potentiation or enhanced efficacy of opioid antinociception were abrogated by the intrathecal inhibition of p38- but not ERK-1/2- MAPK suggesting a crucial role for NGF dependent signal pathways such as p38 MAP kinase. Endogenous opioid peptides (END, ENK and DYN) are the ligands of such opioid receptors on sensory neurons. They are released during stressful stimuli and interact with peripheral opioid receptors to inhibit pain. However, the subcellular pathways of POMC, PENK and PDYN processing into END, ENK and DYN have not yet been delineated in inflammatory cells. Double immunofluorescence confocal microscopy showed colocalization of the opioid precursors POMC, PENK or PDYN with their key processing enzyme (PC2) within subcutaneous inflamed paw tissue. Immunohistochemistry and Western blot detected accumulation of the precursor proteins POMC, PENK or PDYN within circulating and resident immunocytes of PC2 knockout mice. Consistently, radioimmunoassay measured significant decreases in the total content and formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP)-induced release of opioid peptide endproducts END, ENK and DYN from immune cells. Inflammatory pain can be controlled by intraplantar opioid injection or by secretion of endogenous opioid peptides from leukocytes in inflamed rat paws. Antinociception requires binding of opioid peptides to opioid receptors on peripheral sensory nerve terminals. In the absence of inflammation, hydrophilic opioid peptides do not penetrate the perineurial barrier easily and, thus, do not elicit antinociception. Therefore, the aim was to examine the conditions under which endogenous, neutrophil-derived hydrophilic opioid peptides (i.e. Met-Enkephalin and β-endorphin) can raise nociceptive thresholds in noninflamed tissue in rats. Following intraplantar treatment with hypertonic saline, the perineurial barrier was reversibly permeable for hours and intraplantar injection of opioid peptides increased mechanical nociceptive thresholds. In addition, MIP2-induced recruitment of opioid peptide containing leukocytes into subcutaneous tissue without affecting the integrity of the perineural barrier resulted in the establishment of formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)-triggered opioid peptide release and subsequent pain inhibition. Taken together, in addition to the opioid system within the central nervous system increasing evidence suggests a role for the opioid system in the peripheral nervous system. Under conditions of inflammatory pain the number of opioid receptors on peripheral sensory nerves is up-regulated in an NGF p38 MAPK kinase pathway. In parallel opioid peptide expressing immune cells migrate from the circulation into direct vicinity of these nerves to release opioid peptides upon correct processing from their precursors to biologically active end products. In PC2 knockout mice this opioid processing was hindered leading to an accumulation of precursors and a lack of opioid peptide endproducts to be released. The perineural barrier which normally prevents opioid peptides from their access to peripheral opioid receptors is destroyed under inflamed conditions. Under non-inflammatory conditions the access of opioid peptides can be facilitated by hypertonic solutions. Antinociception mediated by endogenously released opioid peptides has, therefore, three important requirements: 1) a critical number of opioid receptors at the peripheral sensory neurons; 2) opioid peptide expression, correct processing and release from leukocytes and 3) opening of the perineurial barrier for opioid peptide access to sensory neuron opioid receptors. This may be important for intrinsic mechanisms of pain control as has been shown in the context of stress-induced analgesia.
URI: urn:nbn:de:kobv:83-opus-32241
http://depositonce.tu-berlin.de/handle/11303/3278
http://dx.doi.org/10.14279/depositonce-2981
Exam Date: 9-Sep-2011
Issue Date: 20-Oct-2011
Date Available: 20-Oct-2011
DDC Class: 570 Biowissenschaften; Biologie
Subject(s): MAPK
Nervenwachstumfaktoren
Opioid Rezeptoren
Opioidpeptide
Prohormone Konvertasen
MAPK
Nerve growth factors
Opioid peptides
Opioid receptors
Prohormone convertases
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